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Cell-in-cell(细胞叠套)是指一个或多个细胞进入另一个细胞形成细胞套细胞的结构,并产生生物学效应的现象,普遍发生于低等到高等生物中,是一种古老和特殊的细胞相互作用模式。Cell-in-cell可以发生于同质细胞间(最常见于肿瘤细胞-肿瘤细胞),也可发生于异质细胞间(最常见于肿瘤或上皮细胞-免疫细胞)。Cell-in-cell形成后内外细胞的命运是多元化的,但最常见的是进入的细胞(又称效应细胞)在被进入的细胞(又称靶细胞)中死亡。Cell-in-cell在体内可以发生在各类组织特别是炎症和肿瘤组织中,而cell-in-cell在其中扮演的角色日益正受到关注,并成为一个生命科学研究的新热点。我们在体内cell-in-cell的筛查过程中,发现在一些病毒感染的组织,如艾滋病人的肠上皮组织、EB病毒阳性的鼻咽癌组织以及肺外结核分歧杆菌的病灶中,普遍存在免疫细胞与上皮细胞形成的cell-in-cell结构。其中鼻咽癌组织中,参与形成cell-in-cell的B淋巴细胞和上皮细胞均存在不同程度的EB病毒感染;而在艾滋病人的肠上皮组织中,HIV-1阳性的T淋巴细胞也可以进入上皮细胞,而上皮细胞内也可以检测出HIV-1核心蛋白p24。通常EB病毒和HIV-1主要入侵的宿主细胞分别是B淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞,而在不表达这些病毒的受体的上皮细胞中检测出病毒成分,则提示我们靶细胞内的病毒可能来自于进入的效应细胞。基于以上体内的观察结果,并在团队提出的cell-in-cell可以改变靶细胞的生物特征并导致微环境改变的“cell-in-cell微环境应激模式”的指导下,我们在体外使用B淋巴瘤来源的感染含GFP报告基因重组EB病毒的EBV-eGFP Akata细胞作为效应细胞,未感染的肿瘤来源上皮细胞系CNE-2作为靶细胞,研究cell-in-cell过程在介导EB病毒在细胞间传播的作用以及对靶细胞特征的影响。我们发现在体外EBV-eGFP Akata细胞可以进入肿瘤上皮细胞系中形成cell-in-cell,而cell-in-cell的发生可以使EBV-eGFP Akata细胞内处于潜伏状态的EB病毒发生活化并进入裂解复制阶段,这个活化过程依靠PI3K/AKT信号通路的激活。进入后EBV-eGFP Akata细胞的主要命运是死亡,但也可以长时间在胞内存活或是逃逸出CNE-2细胞。此外我们通过活细胞工作站观察到发生cell-in-cell后的CNE-2细胞重新表达GFP的过程,预示着EB病毒对CNE-2细胞的感染。经cell-in-cell过程感染的CNE-2细胞可以产出新一轮的EB病毒,与B淋巴细胞产出的病毒相比,具有更加宽的嗜性和更高的感染效率,可以感染其他的健康B淋巴细胞和上皮细胞。我们在非肿瘤的永生化上皮细胞系NEPC1-Bmi1中同样验证了cell-in-cell可以介导这一感染过程。并通过比较cell-in-cell介导的和cell-to-cell(病毒通过细胞间接触传播)介导的感染差异,我们证明这一过程不依赖于裸病毒感染以及细胞间的接触传播,是一种新的病毒传播方式,因此命名为细胞胞内感染(in-cell infection)。我们使用感染HIV-1的T淋巴瘤细胞作为效应细胞,未感染的肿瘤来源上皮细胞作为靶细胞。检测in-cell infection是否也可以促进HIV-1传播至上皮细胞内。我们发现T淋巴细胞可以进入上皮细胞内部,但在cell-in-cell早期发生了迅速的胞内凋亡(emperitosis)。通过免疫荧光检测和透射电镜分析发生cell-in-cell的HIV-1+T淋巴细胞/上皮细胞cell-in-cell结构,我们发现上皮细胞中可以检测出残留的p24蛋白和病毒颗粒,提示在T淋巴细胞凋亡后,上皮细胞在后续对内部细胞的消化和清除过程中获取了T淋巴细胞的组分。随后我们包装了携带GFP报告基因的具备完全复制能力的HIV-1重组病毒感染T淋巴瘤细胞,在这些GFP阳性的T淋巴瘤细胞与上皮细胞发生cell-incell后,上皮细胞未重新表达GFP,提示cell-in-cell发生无法有效介导HIV-1对上皮细胞的产出性感染,我们推测HIV-1+T淋巴细胞进入后上皮细胞迅速发生的凋亡,使其内部HIV-1的组分未能及时在T淋巴细胞膜表面组装成完整病毒颗粒而在凋亡过程中被降解,从而影响后续的病毒传输过程。且不同病毒在胞内的转运过程中可能存在不同的机制,因此in-cell infection机制在不同的效靶细胞和病毒相互作用过程中,具有不同过程和产出。一些病毒如EB病毒、人乳头瘤病毒、乙肝病毒等的慢性感染,被认为与肿瘤的发生发展密切相关,其持续性感染的机制以及治疗一直是基础研究和临床的重点。本课题在体内受感染组织中cell-in-cell的发现,以及经体外实验提出的in-cell infection感染模式,表明cell-in-cell不仅参与病毒的潜伏激活过程,并有可能使组织中的其他细胞发生感染并成为病毒的感染池,揭示了cell-in-cell在参与病毒发病过程中的作用。因此未来对in-cell infection过程的机制研究,将进一步帮助我们理解病毒的传播方式,也可以为病毒持续感染研究和防治提供新的思路和切入点。