子宫是女性最为重要的生殖器官之一,而子宫内膜作为女性受精卵着床、胚胎发育以及妊娠维持的场所,是妊娠取得成功的关键性因素。子宫内膜极易受感染、内分泌、药物及各种宫腔操作(诊断性刮宫,宫腔镜手术、人工流产等)的损伤,造成子宫内膜纤维化及功能性子宫内膜的丧失,形成宫腔粘连(IUA),进而导致胚胎的种植失败,女性继发不孕。目前IUA的主要治疗方法为宫腔镜下IUA分离术,术后辅以宫内节育器及雌激素。然而,各种治疗方法仍存在着治愈率低、粘连再发生率高且妊娠率低等问题。对于重度IUA患者来说,其治疗后发生再次粘连的概率比较高(20%-62.5%),且难以解决好患者生育力的恢复以及子宫内膜再生的问题。近年来,学者们在研究中相继发现正常的子宫内膜可表达多种成体干细胞及多能干细胞标志性基因;在人类及小鼠的子宫内膜中存在着少量的拥有集落形成能力的基质细胞;在人月经血的脱落细胞中发现了干细胞(又称子宫内膜再生细胞)的存在;对出生仅三天的小鼠进行细胞标记后发现,子宫内膜的基底层血管周围存在着少量标记细胞,以上均证实了有子宫内膜干细胞的存在。许多研究表明了子宫内膜为一种能周期性更新且拥有高增殖活性的组织,而子宫内膜内存在成体干细胞可能是其能周期性再生的最根本原因。子宫内膜基底层严重受损时,可能伴随有子宫内膜干细胞群的缺失以及内膜功能状态的异常,从而导致子宫内膜功能层出现再生障碍,最终引起子宫内膜的瘢痕性修复以及IUA发生。因此,子宫内膜内源性干细胞的激活或自体/异体干细胞的移植可能对IUA的治疗有效,这为IUA的治疗方法提供了新的思路。干细胞治疗目前作为再生医学工程研究的一个热门领域,为许多难治疗性疾病的临床治疗带来了新的方向与希望。人羊膜上皮细胞(hAECs)是一种来自胎盘内侧羊膜的围产期干细胞,可以分化为三个胚层,显示出多能干细胞的特性,分化能力较强。hAECs是从胎盘分离,收集方法避免了道德伦理上的顾虑,且每个胎盘可提取超过一亿个细胞;hAECs缺乏端粒酶活性,不会致癌。因此,hAECs为一种安全、理想且来源广的干细胞来源。前期研究中,hAECs已经应用于多个领域,如神经系统损伤的修复,肝纤维化及肺纤维化的修复,原发性卵巢功能不全及心肌梗死的治疗等。目前,尚无hAECs治疗IUA的相关研究报道。本课题旨在探讨hAECs移植治疗大鼠子宫内膜损伤的疗效及可能涉及的作用机制,为IUA的临床治疗提供理论依据。第一部分人羊膜上皮细胞的分离、提取、培养、鉴定及体外标记目的:建立hAECs分离、提取及培养方法,探究hAECs的表型特点;PKH26标记hAECs并观察其对细胞增殖活性的影响。方法:(1)从人胎盘羊膜中分离并且提取hAECs,然后用含12%浓度胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基来进行hAECs的培养。(2)通过流式细胞术以及免疫荧光术来检测hAECs的表型特点,从而对提取培养的原代hAECs进行鉴定。(3)用PKH26标记hAECs后,通过流式细胞仪来检测hAECs的标记率,通过CCK-8法来检测被PKH26标记后的hAECs的增殖活性。结果:(1)提取的原代hAECs在接种72h后,60%-70%的hAECs已贴壁,呈圆点状/短梭状,后细胞逐渐地融合成片,并呈现出铺路石样的形态;约9-12d后,hAECs铺满瓶底的90%-100%可进行首次传代。(2)第1代hAECs表达OCT4、SSEA4、NANOG、CK18、CD324、CD29和CD166,不表达HLA-DR、HLA-DQ、CD146、CD34和CD45,证明所培养细胞为hAECs。(3)PKH26标记后的hAECs呈红色荧光,细胞标记率为96.95±3.05%;CCK-8结果表明与未标记的hAECs相比,PKH26标记后的hAECs的细胞增殖活性没有显著性改变。结论:从羊膜分离、提取可获得活性较好且表型稳定的hAECs;PKH26标记hAECs方法较稳定,标记率较高,且并不影响hAECs的增殖活性,是追踪hAECs在体内的迁移、分布及定植的一个有效方法。第二部分人羊膜上皮细胞移植对大鼠受损子宫内膜的修复目的:探讨体内hAECs移植治疗大鼠受损子宫内膜的疗效,为临床治疗IUA提供理论基础。方法:(1)选择8-10周龄且动情周期正常的雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(12只)作为本实验的实验动物,利用机械损伤造模法来构建大鼠宫腔粘连(IUA)模型。将SD大鼠随机分为两组:(1)正常对照组(n=6);(2)模型组(n=6):用自制的刮匙用力地搔刮子宫宫腔的中上段部分。于建模7天后处死大鼠并采集子宫样本。通过HE染色来观察比较子宫内膜形态学的改变,并计数各组大鼠的子宫内模组织的腺体数量;通过MASSON染色来观察比较大鼠子宫内膜的纤维化程度,并分析各组大鼠子宫内模组织的纤维化面积比。(2)选择8-10周龄且动情周期正常的雌性SD大鼠(96只)作为实验动物,将实验大鼠随机地分为四组:(1)正常对照组(n=24);(2)模型组(n=24);(3)hAECs宫腔移植组(n=24);(4)hAECs尾静脉移植组(n=24)。首先,对模型组、hAECs宫腔移植组和hAECs尾静脉移植组的大鼠按照机械损伤造模法来构建大鼠IUA模型。建模7d后,对hAECs宫腔移植组大鼠经子宫原位缓慢地注射0.3ml含5x106个PKH26标记的hAECs的细胞悬液;同时,对hAECs尾静脉移植组经大鼠尾静脉缓慢地注射0.3ml含5x106个PKH26标记的hAECs的细胞悬液。于hAECs移植后2周和4周处死大鼠并采集相关实验样本,追踪hAECs在大鼠体内的迁移、分布及定植情况;通过HE染色来观察比较各组大鼠子宫内膜形态学的改变,计数腺体及血管的数量并测量子宫内膜的厚度;通过MASSON染色来观察比较子宫内膜的纤维化程度,并分析各组大鼠子宫内模组织的纤维化面积比。同时,在相同时间点将其余大鼠合笼交配,分析hAECs移植对大鼠生育力的影响。结果:(1)大鼠IUA模型建立7d后,模型组大鼠子宫腔表面不连续,宫腔狭窄,与正常对照组相比,模型组大鼠的子宫内膜腺体数呈显著减少,但纤维化面积比呈显著增加,表明大鼠IUA模型有效地建立。(2)hAECs经宫腔及尾静脉移植进入大鼠体内后,在子宫基底部均观察到大量红色荧光信号。与模型组相比,hAECs宫腔及尾静脉移植组的子宫内膜厚度、子宫内膜腺体数以及血管数呈显著地增加,而纤维化面积比呈显著减少。(3)合笼交配后,hAECs宫腔移植组(83.33%)和尾静脉移植组(83.33%)的受孕率均显著高于模型组(50%),而正常对照组的所有大鼠均受孕。同时,hAECs宫腔移植组(9.5)、hAECs尾静脉移植组(9)以及及正常对照组(12.5)的平均胚胎数均高于模型组(2.8)。结论:机械损伤法可稳定而有效的建立大鼠IUA动物模型;hAECs宫腔和尾静脉移植可在一定程度上促进受损子宫内膜的再生,并有助于生育力的恢复。第三部分人羊膜上皮细胞移植治疗大鼠子宫内膜损伤机制的初步探讨目的:探讨体内hAECs移植治疗大鼠受损子宫内膜的可能作用机制,为临床治疗IUA提供新方法。方法:将8-10周龄且动情周期正常的雌性SD大鼠(72只)随机地分为四组:(1)正常对照组(n=18);(2)模型组(n=18);(3)hAECs宫腔移植组(n=18);(4)hAECs尾静脉移植组(n=18)。模型组、hAECs宫腔移植组和hAECs尾静脉移植组的大鼠按照机械损伤造模法构建大鼠IUA模型7d后,对hAECs宫腔注射组大鼠经子宫原位缓慢注射0.3ml含5x106个hAECs的细胞悬液;同时,对hAECs尾静脉注射组经大鼠尾静脉缓慢地注射0.3ml含5x106个hAECs的细胞悬液。于hAECs移植后2周处死大鼠并采集子宫样本。通过免疫组化和RT-PCR法来检测促生长因子(碱性成纤维细胞生长因子(b FGF),血管内皮生长因子(VEGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-1))及细胞外基质(ECM)沉积相关因子(I型胶原α1(COL1A1),基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和转化生长因子-β(TGF-β))的表达水平。利用RNA测序技术对各组大鼠的子宫组织进行差异m RNA分析,筛选出差异基因并进行RT-PCR的验证。结果:(1)免疫组化和RT-PCR结果表明了hAECs宫腔和尾静脉移植组的b FGF、VEGF和IGF-1的表达明显地高于模型组以及正常对照组;模型组的COL1A1、TIMP-1和TGF-β的表达显著地高于正常对照组,然而在hAECs宫腔和尾静脉移植治疗后,与模型组相比,COL1A1、TIMP-1和TGFβ的表达显著下调。(2)利用RNA测序技术对各组大鼠子宫组织进行一个转录组分析,发现在hAECs治疗组和模型组中有1035个差异表达的基因,其中包括600个上调的基因和435个下调的基因。GO分析及KEGG分析表明,hAECs治疗组(hAECs宫腔和尾静脉移植组)与模型组之间差异表达的基因主要是富集于PI3K-Akt信号通路,Wnt信号通路,趋化因子信号通路,内质网中的蛋白质加工信号通路,c AMP信号通路以及细胞因子介导的信号通路。筛选了7个差异明显的基因进行RT-PCR验证,其中包括PI3K-Akt信号通路相关的血小板衍生生长因子C(PDGF-C)、血小板反应蛋白1(THBS1)和结缔组织生长因子(CTGF),Wnt信号通路相关的Wnt5a和Snai2,以及趋化因子通路相关的Rho A和Rock。结果与m RNA测序结果一致,即hAECs移植显著下调了纤维化相关因子PDGF-C,THBS1和CTGF的表达,同时显著上调了胚胎发育相关因子Wnt5a、Snai2、Rho A和Rock的表达。结论:hAECs移植可能通过促进b FGF、VEGF和IGF-1表达增加从而促进了受损子宫内膜的修复;通过下调COL1A1,TIMP-1、TGF-β、PDGF-C,THBS1和CTGF的表达来抑制ECM沉积,改善纤维化;通过促进Wnt5a、Snai2、Rho A和Rock的分泌从而促进胚胎着床。