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背景 卵巢癌是迄今预后最差的妇科恶性肿瘤，晚期病例5年生存率仅15～20％，究其原因之一，是初诊时大多数病人已属晚期，伴广泛的腹腔内播散和大量的腹水形成。血管内皮生长因子(VEGF)参与了卵巢癌的进展和腹水形成，是一个重要的与卵巢癌浸润，转移和腹水形成相关的生长因子。有关研究证实，在人类的胃肠道，肾，乳腺，膀胱，前列腺以及卵巢等多个部位的肿瘤都有VEGF的高表达。一般认为，VEGF通过作用于血管内皮细胞促进新生血管形成。其机制主要是VEGF与VEGFRs的结合促进血管内皮细胞的增殖，游走，并增加微血管通透性。VEGF在血管内皮细胞作用于VEGFRs，通过MAPK，PI3K，PLC-γ等信号转导途径介导信号，发挥生物学效应。最近有体外研究发现在血管内皮细胞中VEGF的信号转导有JAK-STAT信号转导通路的参与。在体外培养的血管内皮细胞，VEGF的刺激可以引起STATs磷酸化增强，进一步调控下游靶基因的转录。 近年发现，在各种肿瘤细胞也存在着VEGFRs的表达。肿瘤细胞表达VEGFRs提示VEGF不仅可通过旁分泌途径作用于血管内皮细胞，促进新生血管的形成，支持肿瘤生长，也可能在肿瘤细胞内通过自分泌的方式直接作用于肿瘤细胞本身，促进肿瘤细胞的生长和抗凋亡。但对于在肿瘤细胞内，VEGF如何转导信息，是否遵循血管内皮细胞内的信号转导途径，尤其是STATs是否参与了信号转导目前尚不明确。 浙江大学2003届硕士学位论文在卵巢癌等各种肿瘤中都存在着STAT3的持续活化，STAT3的异常活化常常与肿瘤的发生，发展有关。肿瘤细胞高表达VEGFRS和高活化的STATS，提示STATS磷酸化激活极有可能参与了肿瘤细胞内VEGF信号转导的过程。 本研究采用免疫细胞化学和lestern Blot的方法，测定上皮性卵巢癌细胞株在体外经不同浓度和不同作用时间的VEGF作用下VEGFRZ和P－STAT3的表达，并采用能与VEGPRZ特异性结合的短肽，阻断VEGF对卵巢癌细胞的作用，以观察P－STAT3是否参与卵巢癌细胞株VEGF的信号转导，旨在探索VEGF对卵巢癌直接作用的分子机制。材料和方洁 以上皮性卵巢癌细胞株SKOV－3，Caov－3，3ac为研究对象，采用VEGF（50ng／ml，30。in）刺激三个细胞株作为实验组，无VEGF刺激的三个细胞株作为对照组，检测P－STAT3和VEGFRZ表达，筛选出共表达VEGFRZ和P－STAT3，并且对VEGF刺激表达P－STAT3反应性高的细胞株，作为进一步研究的对象。采用不同浓度（0，5，25，50，100ng／ml）和不同作用时间（0，15，30，45，60min）的VEGF刺激卵巢癌细胞，观察VEGF 的刺激对卵巢癌细胞P－STAT3 表达的影响。进一步以短肽（ATWLPP）作为VEGFBZ 的阻断剂，在不同浓度（o，4o，so，16o，32oVM）和不同作用时间（O，15，30，45，60min）阻断VEGF与VEGFRZ的结合，观察VEGF诱导STAT3磷酸化的变化。采用免疫细胞化学和Western Blot的方法进行蛋白检测。用染色强度计算法对免疫细胞化学结果进行评分和半定量分析，以及采用 Quantity one软件对 oesternBI。t的结果进行半定量分析。 用 one。av ANOVA和 Univariate Analysis of Variance的统计学方法进行相关性分析，显著性水准 a。0．05。所有的数据用 SPSS 10．0 for windows软件包进订处理。结 果1、细胞株筛选 在 SKOV－3，Caov－3，3ac 三个细胞株，均有 p－SlAT3及 VEGFRZ受体的表达。 二 浙江大学2003届硕士学位论文p－STAT3主要定位于胞浆与胞核内，而VEGFRZ主要定位于胞膜与胞浆。半定量分析，发现 VEGF（50ng／。l，30min）刺激后，p－STAT3的增强在 Caov－3细胞增幅最大。因此筛选出Caov－3，不仅共表达VEGFRZ与P－STAT3，而且对VEGF具有较高反应性，作为进一步实验研究的对象。2、定位分析 免疫细胞化学研究发现，D－STAT3在细胞水平的定位与VEGF作用的时间有关，在15min时，主要定位于胞浆及核周，30～45min时主要定位于胞核，60min时，又主要定位于胞浆。3、不同浓度VEGF作用的半定量分析 不同浓度的VEGF刺激Caov－3引起了不同程度的pSTAT3的增强。随着VEGF浓度的增加，P－STAT3表达增强。组间分析显示在各组之间存在显著性差异（P值均为0．000）。在免疫细胞化学中，sng／。IVEGF浓度即可引起p－STAT3的显著增高（P值均为0．000），当VEGF浓度为50ng砌l时，免疫细胞化学方法和蛋白印迹两种方法显示 p－STAT3均Lb ong／ml时显著增加（P值均为 0．000），50ng／ml与 100ng／m浓度之间无显著差异（P值分别为 0．87和 0．052）。4、不同作用时间VEGF作用的半定量分析 不同作用时间VEGF刺激Caov－3引起不同程度p－STAT3的改变。半定量分析显示在不同时间组间存在着显著性差异（P值分别为 0．000，0．001?