论文部分内容阅读
细胞与细胞间的相互作用是组织的结构建成和功能维持的重要前提。睾丸支持细胞和生殖细胞间的相互作用保证精子发生过程的正常进行,两者间相互作用异常将导致精子数量降低或消失。虽然人们已经对一些基因在支持细胞与生殖细胞相互作用中发挥的重要功能有所了解,但是由于方法学的限制人们对雄性生殖系统中支持细胞与生殖细胞间相互作用的分子机制还有很多需要探索。
为了增加对支持细胞和生殖细胞相互作用的分子机制的认识,本文使用多种免疫染色方法对可能与支持细胞和生殖细胞的相互作用相关的微管正端蛋白、驱动蛋白dynein的调节因子(Nudel and NudE)以及Rho GTPase进行蛋白表达和细胞内定位分析。而后利用慢病毒感染培养的支持细胞或显微注射慢病毒进入生精小管,在体内环境下感染支持细胞等方法来研究EB1和CDC42在睾丸内的功能。研究发现微管正端蛋白在睾丸内的表达分布有所不同:EB1只表达在支持细胞中,p150glued只表达在生殖细胞中,APC在支持细胞和生殖细胞中皆有表达。Nudel和NudE较多地表达于生殖细胞中,Nudel较NudE有明显的亚细胞定位。Rho GTPase中Rho定位于支持细胞中包裹精原和精母细胞的细胞部分,Racl定位于支持细胞中包裹所有生殖细胞的部分。我们将专一性表达于支持细胞中的微管正端蛋白EB1作为功能研究的对象之一。通过慢病毒表达载体我们将绿色荧光蛋白和EB1碳端84氨基酸突变体的融合蛋白(EBIC84-GFP)过表达于体内和体外的支持细胞中。在体外培养的支持细胞中,EB1C84-GFP的表达破坏了支持细胞的微管结构的完整性,而GFP本身对此没有影响。在小鼠的睾丸内部,GFP在支持细胞中特异性的表达标记出支持细胞的轮廓。我们第一次勾勒出精子发生过程中各个时相支持细胞不同结构特点的变化。EB1C84-GFP在支持细胞中的表达产生很多效应:在低感染效率的睾丸冰冻切片中,单个被感染的支持细胞的形态发生改变一一支持细胞的胞体变得聚缩,复杂性降低:在高感染效率的睾丸冰冻切片中生精小管横断面的形态变得异常,圆度下降,且生精小管中生殖细胞的数量也有一定降低。通过慢病毒表达载体我们将功能研究的另一个对象CDC42不同形式的蛋白过表达于支持细胞中。通过检测发现CDC42可以调控生精小管中紧密连接结构的完整性和支持细胞在生精小管基底膜上的粘附以及可能参与生殖细胞和支持细胞的相互作用。
通过上述实验,不仅对生殖细胞和支持细胞相互作用的分子机制增加了认识,同时建立了高效的睾丸内特异性表达蛋白分析系统和功能研究的研究平台,为后续的研究工作提供了有效的手段和理论基础。