两面针为岭南地区常用中药,《中国药典》及地方标准收载两面针药材来源混杂,民间作为两面针药材使用的植物有多种,有关两面针药材的基原研究、正本清源工作亟待进行；《中国药典》规定两面针以根入药,使两面针中药资源严重浪费且难以再生,并导致水土流失和生态环境破坏,因此有必要对两面针的根及其他部位进行深入研究,探索扩大药用部位的可行性；近年来以两面针为原料的中成药、功能性日化品等的需求量不断增加,致使两面针药材资源紧缺,市场两面针来源混乱,出现了不少伪劣品,严重影响中成药及其相关产业原料的使用,亟待开展两面针野生转家种的规范化种植研究。本课题以华润三九医药股份有限公司核心产品“三九胃泰”主要原料药之一的两面针为研究对象,开展了两面针的品种调查与整理、两面针的质量标准研究、两面针扩大药用部位研究、两面针规范化种植关键技术研究,为两面针中药资源的可持续综合开发合理利用提供科学依据。并结合两面针的研究,对“中成药生产中关键中药材的科学合理开发利用研究模式”进行探讨和分析,积极探索中成药生产关键原料中药材的可持续发展之路,并通过该研究为中成药企业药材研究开发提供一条新思路。主要研究结果如下。一、开展了两面针及其近缘种的品种调查与整理通过腊叶标本查阅、实地调研和专家咨询等方式,对两面针进行了原植物来源、植株性别、花期、整体植株形态、伴生植物、分布区域和近缘种等方面的研究。研究结果表明：两面针别名、异名较多,正品拉丁学名应为Zanthoxylum nitidum (Roxb.)DC.。其花为单性花；花期与文献描述相比已经提前。栽培条件下有些植株的攀援性减弱而成直立灌木状。该植物在岭南地区分布较广泛,适应性强,虽不属于濒危物种,但目前资源量已明显减少。在广东和广西两省区,两面针生长环境的伴生植物相似度较高。明确了两面针、单面针、毛叶两面针和毛两面针的植物学分类关系：在一些分布区域,常常将叶片仅一面有刺的两面针误称为单面针,其实真正的单面针基原为芸香科植物蚬壳花椒Zanthoxylum dissitum;毛叶两面针Zanthoxylum nitidum var. tomentosum Huang是两面针的变种,需开展进一步研究,拟作为两面针药材的植物来源之一；而毛两面针作为两面针变种的地位已经不复存在,植物分类学家1956年将叶柄和叶总轴有极稀疏的刺,与花序同被小柔毛的两面针定为新变种,命名为疏刺花椒(毛两面针),1974年又将其改为新变型,但在进一步的研究中发现毛两面针与两面针的形态、组织特征无明显区别,且化学成分相近,于是植物分类学家于1987年又取消其变型地位,重新归为两面针。因此目前一些文献将有毛的两面针鉴定为毛两面针是错误的,《中国药典》2010年版(一部)两面针项下的“毛两面针检查项”通过检查“毛两面针素”而判定毛两面针的问题,可能是由于质量标准制订时的实验样品鉴定有误,因此此检查项值得进一步研究和探讨。在本课题后续的研究中,还需进行两面针和所谓的毛两面针的薄层鉴定、分子生物学鉴定、HPLC实验的对比分析,以允分验证两者关系而得出确切结论。二、完善和提高两面针药材的质量标准研究通过对两面针根的横切面及其粉末进行显微鉴定研究,对根的横切面木栓层、韧皮部、木质部显微构造进行了描述,其粉末鉴别特征为草酸钙方昌单个散在或成片存在于薄壁细胞中；木栓细胞排列整齐,或呈长方形、多角形、不规则形,有的内含棕红色或棕黄色物,可见散在棕色块状物；石细胞类圆形、类椭圆型或形状不规则；导管多为网纹或具缘纹孔。该研究为两面针显微鉴定提供了实验依据。通过两面针DNA分子鉴定初步研究,可知,DNA条形码技术应用于两面针鉴定,其方法稳定、可靠。其中以psbA-trnH鉴定效率最高,其次为ITS2,且两者鉴定能力有一定互补性。参照《中国药典》2010年版(一部)薄层色谱法(附录ⅥB),分别建立了两面针中氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱薄层鉴别方法。氯化两面针碱薄层色谱条件为：硅胶G高效预制薄层板,以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液(30：1：0.2)为展开剂,紫外光灯(365nm)检视。乙氧基白屈菜红碱薄层色谱条件为：硅胶G高效预制薄层板,以二氯甲烷-甲醇(40:1)为展开剂,紫外光灯(365nm)检视。通过对两面针进行指纹图谱鉴别研究,建立了两面针根部位的LC/UV和LC/MS共有模式,为利用指纹图谱进行两面针的真伪鉴别、控制两面针药材质量奠定了基础。实验结果表明,不同批次两面针根部位的指纹图谱有一定差别,产地不同的两面针根部位在化学组成上略有不同。通过进行两面针及其混伪品指纹图谱的比较研究,所建立的两面针指纹图谱共有模式可用于两面针与飞龙掌血、竹叶椒、单面针、毛叶两面针等的鉴别。参照《中国药典》2010年版(一部)两面针项下氯化两面针碱含量测定方法,分别对广东、广西产两面针植株的根、茎、叶进行了氯化两面针碱的含量测定。实验结果表明,不同产地的两面针、两面针的不同部位中氯化两面针碱含量存在差异,其中根中含量相对较高(14批样品中氯化两面针碱含量在0.3838～4.7268mg/g之间)；广西产两面针茎中均含有氯化两面针碱,而广东产两面针茎中含有或不含氯化两面针碱成分,且含量相对广西要低,其结果是否由于生长年限、不同种质资源、生态环境等造成的影响,还需要进一步深入研究；两面针叶中不含氯化两面针碱。比较两面针根、茎部位指纹图谱共有模式,两个部位化学成分相似,主要区别在于各组分的含量有差异,但叶部位与根、茎所含成分差异较大。两面针叶在保留时间15～20min处有多个色谱峰,其对应成分未知。计算两面针茎部位的LC/UV指纹图谱共用模式的相似度,其一致性不如根部位,部分批次的相似度较低,可能与茎部位较长而取样位置不同有关。对31批两面针进行了检测,根部位中木兰碱含量在0.52～4.08mg/g之间,白屈菜红碱含量在0.55～6.41 mg/g之间,新棒状花椒酰胺含量在0.21～3.65mg/g之间。各批茎部位中这三个成分的含量较对应的根部位偏低,尤其是白屈菜红碱。与广西产两面针相比,广东产两面针茎部位中的新棒状花椒酰胺含量较高,与根部位相差较小。两面针叶部位基本上不含木兰碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、新棒状花椒酰胺。三、开展扩大两面针药用部位的研究采用对盐酸乙醇致大鼠胃粘膜损伤及对冰乙酸致小鼠扭体疼痛的影响实验,比较两面针根、茎、叶、地上部分4个不同部位的水提物药效的差异。结果表明,两面针4个部位的水提物对大鼠胃粘膜损伤均有一定的疗效,其中叶的水提物药效最好,根的水提物次之,茎和地上部分的水提物药效相似；两面针4个部位的水提物对冰乙酸致小鼠扭体疼痛均有一定镇痛药效,其中叶和地上部分的水提物药效最好,根的水提物次之,茎的水提物药效稍差。通过从化学的角度进行的两面针各部位化学成分、指纹图谱的研究,两面针根、茎中均分别含有氯化两面针碱、白屈菜红碱、木兰碱、新棒状花椒酰胺及其它未知的共有成分；通过两面针各部位的药效学研究,两面针叶、根、茎均有一定的药理活性；《广东省中药材标准》2010年版收载入地金牛(两面针)根、茎入药；《广西中药材标准》1990年版、1996年版收载两面针根、茎或全株入药,而且民间通常是全株入药,为了更好的保护自然资源,建议在选择两面针入药部位时,考虑扩大到全株作为药用部位,后续将继续结合两面针中所含各成分的药理活性,拟找到能够真正评价两面针药材质量优劣的含量测定指标成分或成分群,建立两面针的指纹图谱或特征图谱,提高、补充、完善现行版药典中两面针质量标准的不足,为两面针资源的可持续发展、合理开发利用奠定基础。四、研究制订了两面针规范化生产标准操作规程(SOP)并进行示范基地的建设通过对两面针分布区的多个种植地的自然条件进行调查、种植地环境质量检测与评价,选择广西南宁市郊林屋村作为试验研究基地；通过对两面针Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC不同种质来源研究,以植株大小和叶片大小(光合作用效率)等生物学特性、生长速度、单株产量、抗病害能力、有效成分含量等多种因素为指标筛选出两面针优良品种；通过种植地选择考察,以排水和透气性能良好、土层疏松深厚、肥沃湿润、土壤pH值为5.0～7.0的沙质壤土或富含腐殖质的沙质黑壤土为好；通过种子及扦插繁殖研究,制定了两面针种子采收与保存、播种、插条选择与处理、扦插、苗期管理的方法,经试验对比研究,扦插繁殖须根杂乱、主根细小,且耗费较多人力、物力,故在大面积规范化种植上应采用种子繁殖为主；通过移栽种植研究,确定了整地、移栽、除草培土、追肥、整枝打顶与摘蕾的时间与方法；通过病虫害防治研究,针对两面针种植常见病虫害制定了相应的防治方法；通过采收时间、加工方法等研究,以氯化两面针碱含量等因子为指标,两面针种植4-5年以后即可采收。根据以上实验研究结果,参考当地农民种植经验,总结和制定了两面针规范化生产标准操作规程(SOP)，规定了两面针的野生转家种的种植品种、产地条件、种苗繁育、种植管理、病虫害防治、采收加工、质量要求、包装与标志、运输与贮藏等内容,可用于两面针的大面积推广种植。目前，已在广西南宁市郊区、广东省平远县建设了两面针规范化种植的示范基地。通过开展两面针的上述的研究,初步形成了对“中成药生产关键中药材的科学合理开发利用研究模式”的一些认识。认为中成药企业应该成为“中成药生产关键中药材的科学合理开发利用研究”的主体。中成药企业应该围绕生产的实际需要,针对中成药生产急需中药材存在的资源家底不清、野生转家种栽培关键技术未完善、药材质量不稳定等关键技术问题,在全面资源调查的基础上,参与国家中药材资源的监测预警和信息系统等体系的研究和建立；对中成药生产需要的中药材原料,建立完善的中药材资源监测系统和数据库,在线监测中药材生产存在的主要问题。重点开展药用植物的资源调查、药材野生转家种的规范化种植技术的研究和开发,开展药材化学成分、质量标准和药效学等关键技术的研究和开发,建设药材野生转家种的规范化种植基地,完善建立药材的质量标准,为中医临床用药提供优质的药材,为企业生产提供安全、有效、质量稳定、可控的中药材原料。