基于Bi基钙钛矿的光电化学传感器检测DNA羟甲基化

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5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)是重要的表观遗传修饰物,对基因的表达调控具有重要作用。异常的羟甲基化状态可能会影响染色质结构,导致组织出现相关的疾病。若能对特定状态下的5hm C含量进行检测,就可以总结得到5hm C表达含量的变化规律,以此对生物体早期疾病进行有效的检测、诊断和预后。因此,对生物体基因组DNA中5hm C表达含量的灵敏检测十分重要。由于装置成本低、灵敏度高等优势,光电化学传感器深受研究者关注。目前,选择合适的光电活性材料以提高光电化学传感器的灵敏度是一项重要的研究内容。Bi基钙钛矿Bi4NbO8Cl和Bi4TaO8Cl具有稳定的光电性能和合适的能带带隙,可以通过构建异质结或者染料敏化等方式提高钙钛矿的光电性能,在光电化学传感器基底材料的选择上具有明显优势。基于此,本文利用苝四酸酐(PTCA)敏化的Bi4TaO8Cl、Bi4NbO8Cl@Bi2S3复合物、聚氨基苝羧酸(PTC-NH2)敏化的Bi4NbO8Cl作为光电活性基底材料,设计了能够检测5hm C核苷酸和5hm C核苷的光电化学传感器,实现了对5hm C的灵敏检测。在此基础上,利用构建的传感器实现对植物幼苗根叶中5hm C含量的检测,并初步研究了重金属(镉离子、铅离子)、全氟化合物(全氟辛酸)、外源植物激素(吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸、6-苄基嘌呤)对水稻或小麦幼苗根和叶中5hm C含量变化的影响。本论文研究内容分为以下三部分:(1)采用3,4,9,10-苝四羧酸(PTCA)敏化的钙钛矿Bi4TaO8Cl作为光电活性材料,通过抗原抗体免疫作用构建了对5hm C特异性识别的光电化学免疫传感器。首先利用5hm C抗体捕获目标检测物,再利用5-羟甲基胞嘧啶核苷酸上磷酸基团与四价锆的配位作用,捕获ZrO2和氨甲基膦酸,最后利用氨基与羧基的共价反应,将二茂铁羧酸捕获至电极表面。作为电子供体,二茂铁提供电子,捕获光生空穴,阻止光生电子-空穴重组,促进光生电子迁移,导致光电流增强,实现信号扩增。对制备的钙钛矿Bi4TaO8Cl、PTCA和ZrO2纳米材料进行了表征。在最优条件下,构建的传感器的检测范围宽为0.02~100 n M,最低检测限为0.0052 n M(S/N=3),并展现出良好的选择性、稳定性和重现性。利用该传感器检测了小麦幼苗根和叶中5hm C含量,发现重金属Cd2+和全氟辛酸能够降低5hm C含量。此传感器为重金属和全氟辛酸的生态毒理效应提供了新的思路。(2)以Bi4NbO8Cl@Bi2S3异质结为光电活性材料,基于纳米材料氧化锆为信号扩增单元构建光电传感器检测5hm C核苷酸。首先将分散在壳聚糖溶液中的Bi4NbO8Cl@Bi2S3异质结材料固定于裸ITO电极表面,并借助壳聚糖的氨基连接巯基乙酸,将电极表面修饰巯基基团。接着,在M.Hha I甲基转移酶的催化作用下,5-羟甲基胞嘧啶核苷酸上的羟甲基与巯基反应,形成特异性识别。最后,纳米氧化锆颗粒通过磷酸基团与四价锆的相互作用修饰在电极上,促进了基底材料的光生载流子的迁移,提升了光电信号,实现光电信号的扩增。实验结果表明,构建的光电传感器具有较宽的检测范围(0.3~300 n M)和较低的检测限(0.0779 n M),能够对5-羟甲基胞嘧啶核苷酸进行灵敏检测。此传感器用于研究重金属铅离子和全氟辛酸对小麦幼苗叶片和根系中5-羟甲基胞嘧啶的含量影响。与空白对照组相比,单一Pb2+处理时,叶片中5hm C水平升高,而根系中5hm C水平降低;单一PFOA处理使得小麦叶片和根系中5hm C含量均有所下降。(3)基于钙钛矿Bi4NbO8Cl和PTC-NH2作为光电活性材料构建了一个光电化学传感器用于检测5-羟甲基胞嘧啶核苷。首先将光电材料Bi4NbO8Cl和PTC-NH2依次固定在电极表面,接着利用氨基与羧基的反应捕获巯基乙酸和巯基乙胺,并在电极表面修饰巯基。再利用M.Hha I甲基转移酶催化5-羟甲基胞嘧啶核苷与巯基共价结合,实现靶分子的特异性识别。接着,通过核苷的1,3-二醇结构,捕获醛基苯硼酸,并进一步捕获Fe-MIL-88-NH2纳米粒子。最后,Fe-MIL-88-NH2发挥人工模拟酶作用,在过氧化氢存在下将电极表面的4-氯-1-萘酚(4-CN)催化转化为苯并-4-氯己二烯酮(4-CD)沉淀,阻碍电子传递,猝灭光电信号,实现信号扩增。实验结果表明,该传感器在0.01~100 n M的检测范围下能对5-羟甲基胞嘧啶核苷进行灵敏检测,最低检测限为0.00648 n M。更重要的是,本传感器还被用于研究外源植物激素对水稻幼苗叶片和根系中5-羟甲基胞嘧啶核苷含量变化的检测,培养7天发现4种外源激素对水稻叶片和根中5hmd C的表达均有明显的抑制作用,这为外源植物激素对水稻生长发育的影响研究提供了新的生物标志物。
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