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芽孢杆菌,革兰氏阳性菌,是一种重要的工程菌株,广泛用于工业上脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶的生产。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种模式菌株,具有非致病性、遗传背景清晰、分泌蛋白能力强、容易分离培养等特性,因此是异源蛋白分泌表达的理想宿主。现有的枯草芽孢杆菌启动子不足以满足工业上利用枯草芽孢杆菌大量表达外源基因的要求,因此寻找新型的可以在枯草杆菌中表达可控的强启动子是非常必要的。本课题目的在于探索一种新的筛选芽孢杆菌启动子的方法,通过SDS-PAGE和生物学软件分析芽孢杆菌中筛选启动子,成功获得了具有启动活性的组成型启动子BSP3和诱导型启动子BSP5B,以Saccharomonosra viridis中的麦芽糖α-淀粉酶为报告基因,构建重组质粒 pHCMCO4-BSP3-sva 和 pHCMCO4-BSP5B-sva分别转入B.subtilis 1A857中表达。结果显示BSP3和BSP5B均能在枯草芽孢杆菌中表达SVA基因,通过DNS法测的胞外发酵液最高粗酶活分别为16.248 U/mL、21.758 U/mL。本研究以现有的组成型强启动子P43为基础,与克隆得到的组成型启动子BSP3进行核心保守区域的替换杂交。分别得到杂交载体BSP3D2-sva>BSP3D3-sva>XL3-sva、XL4-sva、XL5-sva、XL6-sva,转入B.subtilis 1A857中,每隔12 h取样测定SVA的酶活及OD600,测得发酵液最高粗酶酶活分别为19.924 U/mL、19.063 U/mL、14.982 U/mL、20.578 U/mL、26.142 U/mL、17.538 U/mL,OD600值分别为4.308、3.592、3.35、3.35、6.418、4.672,单位生物量含有的粗酶酶活单位分别为 4.624 U/mL、5.307 U/mL、4.470 U/mL、5.036 U/mL、4.073 U/mL、3.754 U/mL。BSP3D3-sva表达效果较佳是原 BSP3 启动子表达活性的1.11倍。XL4-sva表达效果是P43启动子表达活性的1.44倍。说明集中不同启动子的优势核心保守区域,可以优化启动子的结构提高启动子的转录效率。本课题在成功构建的表达载体pHCMC04-BSP5B-sva的基础上,对诱导型启动子BSP5B的核心保守区域定点突变,得到突变载体BSP5B-35A-sva、BSP5B-10A-sva、BSP5B-10B-sva、BSP5B-35C-sva、BSP5B-10C-sva,转入B.subtilis 1A857表达测得SVA发酵液最高粗酶酶活分别为 21.991 U/mL、23.595 U/mL、31.156 U/mL、43.228 U/mL、35.981 U/mL,OD600 值分别为 5.115、4.992、5.28、5.318、4.592,单位生物量含有的粗酶酶活单位分别为4.299 U/mL、4.793 U/mL、5.899 U/mL、8.130 U/mL、7.836 U/mL。突变体 BSP5B-35C-sva、BSP5B-10C-sva突变优势明显,表达活性是原BSP5B启动子的1.75倍、1.69倍。该实验结果显示,突变启动子核心保守区域会改变启动子的转录活性,将启动子的核心保守区域定点突变为经典启动核心保守区域会提高启动子的转录活性。