研究背景与目的伴t(8；21)/AML1-ETO融合基因阳性急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia with t(8;21)/AML1-ETO-positive,以下简称AE-AML)已被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)划分为独立亚型,是AML中常见的亚型之一,占5%-10%；异质性极大,表现为髓外侵犯多见,C-KIT基因突变高发,常伴有附加核型异常,治疗效果各亚组间存在显著差异。关于AE-AML预后的影响因素,除了与外周血白细胞计数、髓外侵犯、CD56表达、附加核型异常等等有关外,近年来,越来越多的学者关注到了分子生物学异常,包括基因突变或过表达,对该亚型白血病的发生、发展及预后的影响。C-KIT基因突变已被证实是AE-AML最常见的基因事件,发生率高达12.8%-48%,且是该亚型白血病的不良预后因素,已被美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network. NCCN)指南纳入AML预后分层指标；C-KIT基因突变已被证实可以协同AML1/ETO融合基因导致白血病发生。除此之外,还有包括FLT3/ITD、TEL/PDGFRβ、WT1等不少基因突变已被证实参与了该亚型白血病的发病过程且影响疾病预后。有学者用一代测序的方法分析了139例AE-AML患者的基因突变情况,结果显示,有49.6%患者出现附加基因突变,其中16.5%出现≥2个附加基因突变,66.7%的患者在复发后出现分子生物学的克隆演变；附加基因突变数及C-KIT、ASXL1基因突变是预后的不良因素。由此可见,基因突变在AE-AML患者中并不少见,且在白血病的发生、发展及预后的影响中占有极为重要的地位。检测该亚型白血病的基因突变谱,分析不同基因突变对临床特征及预后的影响,有助于深入了解该亚型白血病的发病及耐药机制,为精准治疗提供依据。但是以往研究基因突变的方法是Sanger测序,该方法检测灵敏度低、通量低、费用昂贵,耗时长,检测灵敏度只能达到20%左右,在研究基因突变谱时受到了很大的限制,成了制约AML分子研究的瓶颈。Ion Torrent个体化基因组测序仪(Personal Genome Machine, PGM)是Thermo Life公司新推出的一款测序仪,具有准确度高、运行速度快、灵活性大等优点。已有文献报道利用该测序技术分析ABL激酶区基因突变类型对酪氨酸激酶抑制剂的耐药情况来指导治疗方案的制定。我们在Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel V2试剂盒基础上,新增17种AML相对特异的突变基因并重新设计定制了多重PCR测序引物池,在前期采用Ion Torrent PGMTM测序技术检测了27例核型正常的AML患者在首次治疗前的基因突变情况,并用Sanger方法验证了新一代测序技术(Next generation sequencing, NGS)测序结果的可靠性,结果显示两种方法的一致性为100%,成功的建立了一套灵敏特异、可靠、高通量的AML基因突变检测方法。本研究利用该技术方法,对64例初发AE-AML患者的基因突变情况进行检测并分析部分患者复发时基因突变克隆演变情况,以期更深入了解该亚型白血病的基因突变特征,为后期研究白血病的发病及耐药机制和研发新的治疗靶标提供依据。另外,基因的过表达也是AE-AML预后的不良因素。文献报道AML1/ETO融合基因的异构体AMLl/ETO9a在AE-AML中高表达,参与该亚型白血病的发生,并与C-KIT高表达／基因突变有关而且还影响疾病预后。淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)基因位于21q21.3,其编码的蛋白产物APP在某些实体瘤中表达增高并促进瘤细胞增殖,影响疾病预后。文献和我们前期研究均发现APP基因在AE-AML中高表达。我们还发现APP基因通过p-ERK/c-Myc/MMP-2通路调控AE-AML细胞的髓外浸润。由此可见,APP基因是AE-AML发展中重要的因素。本研究拟通过分析AE-AML患者初发病时骨髓细胞APP基因表达水平对患者临床特征的影响,进而利用kasumi-1细胞模型进行体外实验,深入研究APP基因对AE-AML细胞的生物学行为的影响并初步探讨其分子机制。鉴于AE-AML预后异质性较大,影响预后的因素较多,如何系统评价这些指标的预后意义,建立分层诊断体系指导分层治疗,具有临床实用价值。目前相关研究主要局限于单个或者多个因素对预后的影响。本研究拟纳入包括基因突变和APP基因表达异常在内的多重指标进行多因素分析,建立新的预后分层体系,为临床分层治疗提供参考。材料与方法第一部分研究对象：2006.4-2013.12期间在南方医院诊治的64例初发AE-AML患者,采集研究对象为初次治疗前和复发时的骨髓标本,提取核酸待检。方法：1、临床资料的收集收集发病时的临床特征：包括性别、年龄、髓外侵犯、血常规、骨髓形态学、核型分析、免疫表型。2、样本准备按照DNA提取试剂盒说明书操作,分别从骨髓细胞涂片和新鲜骨髓标本中提取核酸。3、NGS测序1)构建文库用Qubit dsDNA试剂盒检测DNA浓度,稀释到5ng/μl。依据仪器配套试剂盒说明书,经扩增目标DNA、消化引物、加barcode接头、纯化扩增文库后,采用Ion Library Quantitation Kit对文库定量。2)乳液PCR和阳性模板富集采用Ion PGMTM Template OT2 200 Kit进行乳液PCR；用Dynabeads(?) MyOneTM Streptavidin C1 Beads进行阳性模板富集。以上两步反应在Ion OneTouchTM系统上进行。3) Ion Torrent PGM测序用The Ion 316 Chip Kit,在PGM上测序,测序结果用PGM服务器配套的Ion Torrent Software Suite数据分析软件进行初步分析,得到整体数据量、变异信息、平均测序深度和参考序列匹配程度等数据。原始结果再经过一系列的过滤条件之后,得到最终结果。参考序列为人类基因组GRCh37。第二部分研究对象：临床研究：2006.2-2013.12期间在南方医院诊治的65例初发AE-AML患者,其中50例与第一部分重叠,采集研究对象为初次治疗前、缓解后1、3、6、12、24、36月和复发时的骨髓标本,提取RNA和DNA待检。体外研究：野生型kasumi-1细胞株(wild)、转染了scramble序列的kasumi-1细胞株(NC)、转染了干扰APP序列的三组kasumi-1细胞株(siAPP)方法：(一)临床研究l、临床资料的收集收集发病时的临床特征：包括性别、年龄、髓外侵犯、血常规、骨髓形态学、核型分析、免疫表型。2、Sanger测序用Sanger测序检测所有标本的C-KIT基因8和17号外显子和FLT3-ITD基因的突变情况。3、NGS测序方法与第一部分相同。4、APP基因和C-KIT基因表达量的检测1)标本准备从新鲜骨髓标本中提取总RNA,按照PrimeScriptTMT逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成。2)实时定量(RTQ)-PCR方法定量检测APP基因和C-KIT基因nRNA表达选择β-actin作为内参照,设计APP和C-KIT基因的引物,进行RTQ-PCR检测,确定PCR产物的特异性,计算各标本mRNA的相对表达量。(二)体外研究1、QRT-PCR方法检测各组细胞的APP和C-KIT mRNA的表达2、流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡和CD117阳性的表达3、DNA含量检测试剂盒检测各组细胞的细胞周期分布4、Western Blot检测各组细胞的C-KIT、AKT、p-AK、Bcl-2、Caspase-3、 Caspase-9、NF-κB和p53等蛋白水平5、Sanger测序检测各组细胞的C-KIT基因突变第三部分研究对象：第一和第二部分研究对象中同时接受了Ion Torrent PGM测序和APP基因定量检测的50例AE-AML患者,采集研究对象为初次治疗前、缓解后1、3、6、12、24、36月和复发时的骨髓标本,提取RNA和DNA待检。方法：1、临床资料的随访和收集收集发病时的临床特征：包括性别、年龄、髓外侵犯、血常规、骨髓形态学、核型分析、免疫表型；随访患者的早期治疗反应(包括血液学缓解和分子生物学缓解)、总生存和无复发生存。2、NGS测序方法与第一部分相同。3、APP基因表达量的检测与第二部分相同。4、诱导化疗：蒽环类药物联合阿糖胞苷的“3+7”方案1-2疗程；巩固治疗：缓解后接受标准剂量阿糖胞苷为基础(standard-dose Ara-C-based, SDAC-based)或中剂量阿糖胞苷为基础(median-dose Ara-C-based, MDAC-based)的方案巩固化疗。结果第一部分1、AE-AML初发病时骨髓细胞的基因突变特征64例患者中有47例出现中位2(1-14)种附加基因突变,发生率为73.4%,其中出现1种基因突变有14例,发生率为21.9%≥2种基因突变有33例,发生率为51.6%；总共检测到29种基因突变,所有检出的突变以杂合型突变为主,基因突变类型以单碱基替换为主。发生频率最高的是KIT基因突变(31/64,48.4%),包括D816 (exon 17)突变13例、N822 (exon 17)突变5例、M541(exon 10)7例、Pro518Leu (exon 10)4例、R815_D816ins (exon 17) 1例、c.1253delACG (exon 8) 1例；依次分别为ASXL119例(29.7%),DNMT3L和MET各11例(17.2%),KMT2A和MLH1各9例(14.1%),DNMT3A8例(12.5%),DNMT3B、PAX5和FBXW7各6例(9.4%),NRAS5例(7.8%)等等。2、不同基因突变对临床特征的影响伴有ASXL1突变者的EML发生率明显增高(9/19 vs.11/44,P=0.071),CD56+表达率显著增加(18/19 vs.23/44,P=0.001),伴有FBXW7突变患者的CD56+表达率也明显增加(6/6 vs.35/57,P=0.059)；伴有DNMT3L突变者的骨髓原始细胞比例显著增加[中位52.3(13.0-94.0)%vs.35.0(13.0-93.)%,P=0.039]；伴有KMT2A突变患者的CD19+表达率显著增高(7/9 vs.21/54,P=0.030),附加核型异常发生率则明显下降(1/7 vs.23/55,P=0.069)；其他基因的突变型和野生型两组的临床特征无显著差异。3、AE-AML复发时的分子生物学克隆演变11例AE-AML患者在复发时比初次诊断时有6例发生了克隆演变,发生率为6/11(54.5%)；有5例获得新的克隆,包括KMT2A、KIT和TET2等基因突变,另外有3例发生了克隆丢失,包括KIT、NRAS基因突变丢失；KIT基因突变在克隆演变过程中出现频率最高(2例新增,2例丢失)。第二部分1、初发病时骨髓细胞的APP基因表达量对AE-AML临床特征的影响1)APP基因与C-KIT (exon 8,17)基因突变/高表达相关17/65例出现C-KIT (exon 8,17)基因突变,其中13例位于APP高表达(APP-H)组,4例位于APP低表达(APP-L)组,两组有统计学差异(P=0.009)；9/50例出现C-KIT (exon 10)基因突变,4例位于APP-L组,5例位于APP-H组,两组的发生率无明显差异(P=0.976)；检测的其他基因突变在两组间无显著差异。Pearson rank相关性分析显示APP mRNA的相对表达量与C-KIT mRNA的表达水平呈正相关性(r=0.621,P<0.001)。2)APP基因对其他临床特征的影响APP-H组的中位WBC计数为29.3±4.0×109/L,骨髓髓细胞比例为85.8%±2.2%,EML发生率为11/32,均显著高于APP-L组(WBC：18.1±2.8×109/L,P=0.011；骨髓髓细胞比例：80.2%±2.3%,P=0.039；EML.：3/33,P=0.013)；其他临床特征两组间均无显著差异(P值>0.05)。2、APP基因对kasumi-1细胞凋亡和细胞周期的影响Wild、NC和siAPP组早期凋亡率分别为21.43%±0.86%、21.67%±0.78%和29.00%±0.98%(F=71.927,p=0.000)；siAPP组分别与Wild组和NC组比较,P值均为0.000,具有统计学差异。Wild组、NC组和siAPP组晚期凋亡率分别为12.33%±0.75%、12.90%±1.25%和19.80%±1.51%(F=0.600,P=0.579)；siAPP组分别与Wild组和NC组比较,P值均为0.000,具有统计学差异,说明干扰APP表达后细胞的早、晚期凋亡率均显著增加。Western blot检测结果显示siAPP组的Bcl-2表达量较Wild组和NC组明显下降,而Caspase-3和Caspase-9表达量则升高,说明下调APP表达后抗凋亡因子Bcl-2表达下降,而促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达升高,与细胞凋亡检测结果一致,证实APP基因调控kasumi-1细胞的凋亡。流式细胞术分析Wild、NC和siAPP三组细胞的细胞周期分布情况,结果三组均无显著差异(P值均>0.05),提示APP基因对细胞增殖无明显影响。3、APP基因调控C-KIT基因表达流式细胞术检测结果显示siAPP组的CD117阳性表达率为81.05%±1.38%,NC组为92.150%±1.56%,Wild组为91.28%±1.98%,三组差异有统计学意义(F=45.27,P=0.000)；siAPP组分别与Wild组和NC组比较,P值均为0.000,具有统计学差异。RTQ-PCR方法检测siAPP组的C-KIT mRNA相对表达量为0.05273±0.00873,NC组为0.08707±0.00676,Wild组为0.09008±0.00712,三组差异有统计学意义(F=22.46,P=0.002)；siAPP组分别与Wild组和NC组比较,P值均为0.001,具有统计学差异。Western blot分析结果亦显示siAPP组的C-KIT表达水平较NC组和Wild组显著下降。以上结果证实APP基因参与C-KIT基因表达的调控。4、APP基因参与PI3K/AKT信号通路调控Western blot检测结果显示siAPP组的p-AKT、NF-κB、p53和Bcl-2的表达水平较NC组和Wild组均显著下降,说明下调APP基因表达,PI3K/AKT信号通路表达下调。第三部分1、疗效两疗程累积缓解率为95.8%(46/48),总缓解率为100%(48/48),两疗程巩固化疗后累积主要分子学缓解(major molecular remission, MMR)率为46.7%(21/45)；中位随访23(4-85)月,累积复发率为50.0%(24/48),累积死亡率为33.3%(16/48)。2、AE-AML预后的影响因素1)早期治疗反应的影响因素对于两疗程巩固化疗后MMR的影响,伴有附加基因突变,特别是DNMT3A、MLH1和C-KIT (exon 8,17)等基因突变的影响较为显著；其他临床特征则无显著影响。2)无复发生存和总生存的影响因素单因素分析结果显示,初发病时的临床特征,包括髓外白血病、骨髓髓细胞比例≥90%、APP-H、伴有附加基因突变,特别是MET、ASXL1、DNMT3A、MLH1和C-KIT (exon 8,17)等基因突变均是无复发生存(relapse free survival,RFS)、总生存(overall survival, OS)的不良因素,另外,KMT2A突变是RFS的不良因素,FBXW7突变是OS的不良因素；缓解后接受MDAC-based方案巩固化疗和两疗程巩固化疗后获得MMR均是RFS和OS的保护性因素。多因素分析结果显示MET、ASXL1突变和APP-H是RFS的不良因素,而仅有MET突变是OS的不良因素,两疗程巩固化疗后获得MMR是RFS和OS的独立保护性因素。3、AE-AML分层诊断体系的建立根据AE-AML预后因素多因素分析结果,APP-H、ASXL1、MET基因突变和两疗程巩固化疗后未获得MMR均是RFS和/或OS的不良预后因素,定义以上每项不良因素分值为1分,没有不良因素者为0分,最高积分为4分。合并积分3和4分组。积分0分(n=9)、1分(n=16)、2分(n=13)和3-4分(n=10)组的RFS率分别为61.5%±8.2%、61.9%±6.2%、34.2%±6.0%和14.8%±2.2%(P<0.001),OS率分别为64.5%±6.1%、84.2%±4.6%、32.6%±6.9%和14.8%±2.2%(P<0.001),均存在显著差异。结论1、73.4%AE-AML患者初发病时发生了基因突变,其中C-KIT突变最常见,其次是ASXL1突变；不同基因突变对患者的临床特征存在显著影响,在疾病复发时大部分患者出现分子生物学克隆演变。2、APP基因与C-KIT (exon 8,17)突变有关；APP基因参与了AML1/ETO阳性白血病细胞凋亡的调控而对细胞增殖无明显影响,其分子机制可能是APP基因通过C-KIT基因表达异常,调控PI3K/AKT信号通路进而影响细胞凋亡。3、APP高表达和ASXL1基因突变是AE-AML患者RFS的不良因素,MET基因突变是RFS和OS的不良因素；两疗程巩固化疗后获得MMR是RFS和OS的独立因素；纳入基因突变、APP基因高表达和MRD监测水平等指标的分层诊断体系具有早期预测预后价值。