研究背景及目的酗酒是当前社会的热点问题,无论是短期内大量酒精摄入还是长期慢性酒精依赖都会导致严重的肝脏损害。酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)是过量酒精摄入后最常见且最早出现的肝损害形式,可进展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化甚至肝癌。有调查研究指出,长期酗酒者中90%以上可以发展成为脂肪肝,其中20%-40%的酒精性脂肪肝患者可发展为肝纤维化,8%-20%可发展为肝硬化,3%-10%的患者可最终发展为肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)。在我国,酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝脏损伤的第二大病因,酒精性肝病是严重影响我国人民生命健康的公共卫生问题。然而目前,酒精性脂肪肝的发病机制尚未明确,临床上缺少有效的靶向治疗手段。为深入研究其发病机制,开发出更多有效的防治药物,需要建立一种简单易行而又经济实用的动物模型。目前,国内外传统的酒精性脂肪肝模型常以啮齿类动物作为实验对象,主要采用灌胃或腹腔注射酒精的方法,平均实验周期约为1-16周。与啮齿类动物相比,斑马鱼具有饲养经济、方便；发育迅速,产卵量多,容易获得足够的样本量；体外受精,胚胎透明,便于显微镜下观察肝脏；体积小,适合大规模饲养,有利于高通量药物筛选等独特优点,很好地解决了啮齿类动物模型操作复杂、样本量局限、实验耗费相对较高且周期较长的问题。与此同时,有研究指出,斑马鱼体内拥有代谢酒精所需的关键酶,肝脏在胚胎发育的第四天便开始成熟,乙醇可以直接加入水中,是进行酒精性肝病研究和相关药物筛选的理想模式生物。然而,目前国内对酒精性脂肪肝的基础研究仍以啮齿类动物为主,尚未有酒精性脂肪肝斑马鱼模型的报道。异甘草酸镁(Magnesium isoglucyrrhizinate, MgIG)通名异甘草酸镁注射液,为传统中药甘草中的单一立体异构体。MgIG作为第四代甘草酸类制剂,具有更强的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。临床上主要用于慢性病毒性肝炎病人的治疗,能够有效改善肝炎病人的肝功能状态。近年来大量基础研究也表明,MgIG对各种化学性、药物性肝损害和非酒精性脂肪肝等具有保护作用。另外,其在酒精性肝病中的作用也逐渐明确,但对于酒精性脂肪肝的防治研究报道甚少,且其具体作用机制也尚不明确。本研究基于以上研究背景,利用斑马鱼独特的生理结构优势,以其作为模式生物,采用直接将乙醇加入斑马鱼培养用水中的方式,通过观察不同浓度乙醇处理后斑马鱼一般生存率和表型变化,整体油红染色观察肝脏形态、肝内脂滴沉积情况并评判脂肪肝发生率,石蜡切片观察斑马鱼肝组织病理变化,Real-time RT-PCR检测脂质代谢途径相关基因表达,选取最佳乙醇浓度和处理时间点在国内首次建立一种简单易行、重复性好的急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型。在此模型基础上,给予高、中、低三个浓度异甘草酸镁干预后,通过观察斑马鱼肝脏形态、脂肪肝发生率及肝脏病理等关键指标,评估异甘草酸镁对急性酒精性脂肪肝是否具有保护作用。最后,从脂质代谢方面初步探讨异甘草酸镁的防治机理。以期为酒精性脂肪肝防治药物的开发和相关机制研究开拓新的思路。研究内容一.方法1、实验动物野生型AB品系斑马鱼由南方医科大学细胞生物教研室斑马鱼实验室提供。按照Westerfield方法对斑马鱼进行养殖。光照周期维持L:D=14h:10h,温度维持在28.5℃。雌雄成鱼自然交配,收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中,置于恒温孵箱中28.5℃孵育。2、酒精处理受精卵发育到5dpf,挑选肝脏发育正常的幼鱼分别给予斑马鱼0%、2.0%、2.5%和3.0%乙醇处理直至32h。为防止乙醇挥发,加盖后用Parafilm封条封闭。3、斑马鱼整体油红染色收集处理后的斑马鱼于染色皿中,4%多聚甲醛固定过夜,PBS洗涤2次,丙二醇从低浓度到高浓度渗透,0.5%油红避光孵育过夜。同样浓度丙二醇从高浓度到低浓度洗净背景,80%丙二醇4℃冰箱保存。每组随机挑选20条,Olympus szx10体式显微镜下观察肝脏脂肪变性情况并进行拍照,记录脂肪肝发生率。4、病理组织切片4%多聚甲醛固定斑马鱼过夜,不同浓度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡后包埋,4μm切片,行苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,Olympus BX51光镜下观察肝脏病理变化。5、Real-time RT-PCR收集处理后的斑马鱼置于1.5ml EP管中,每组约36条。迅速加入Trizol,按照步骤提取总RNA。RNA浓度、纯度通过紫外分光光度法(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, USA)测定。利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA)试剂盒反转录成cDNA。实时定量聚合酶连锁反应采用Applied Bio systems7500Real-Time PCR System进行检测。6、统计学分析应用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用两个独立样本t检验。组间两两比较用LSD检验。作图用Sigmaplot10.0软件。P<0.05有显著统计学差异。二.结果第一章急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型的建立1、乙醇对斑马鱼生存率的影响乙醇处理后24h,随着乙醇浓度增高,斑马鱼生存率逐渐降低。乙醇处理后32h后各组生存率差异显著。2.0%、2.5%和3.0%乙醇处理组斑马鱼32h内生存率分别为100%、(91.21±1.61)%、0%。2、乙醇对斑马鱼表型和活动度的影响乙醇处理后24h,2.0%乙醇处理组斑马鱼形态基本正常,观察其活动度增加,游动异常,表现为转圈、窜动。3.0%乙醇处理斑马鱼全部静止不动,出现表型变化,表现为：脊柱弯曲,心包水肿,体腔出血,卵黄囊水肿,鱼鳔未形成。2.5%乙醇处理组斑马鱼中部分出现以上表型变化。3、乙醇对斑马鱼肝脏形态的影响整体油红染色结果显示：与对照组相比,2.0%乙醇处理组斑马鱼在处理32h后肝脏明显肿大。4、乙醇导致斑马鱼肝内大量脂滴沉积整体油红染色后分离对照组和2.0%乙醇处理组斑马鱼肝脏组织,2.0%乙醇处理组斑马鱼肝脏组织染色明显加深,肝内有点状脂滴沉积,严重的脂滴布满全肝。5、乙醇对斑马鱼脂肪肝发生率的影响整体油红染色结果显示：2.0%乙醇处理组斑马鱼在处理32h后脂肪肝发生率显著高于对照组((71.25±0.15)%对比(31.25±0.05)%,户5.102,P=0.002),而24h时,两组脂肪肝发生率无统计学差异((17.50±0.15)%对比(7.50±0.05)%,t=1.265,P=0.253)。6、乙醇对斑马鱼肝脏组织病理的影响光镜下观察肝脏组织病理改变,对照组斑马鱼肝组织形态学表现正常,2.0%乙醇处理32h后斑马鱼肝细胞肿胀、肝内脂滴沉积增多、脂肪肝形成。7、乙醇对斑马鱼脂质代谢途径相关基因的表达水平的影响乙醇处理24h时,脂质代谢相关基因accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA在2.0%乙醇处理组中的表达量分别为对照组的(2.9401±0.4845)、(2.8733±0.7876)、(6.5050±4.8122)和(3.1762±1.3638)倍,表达水平明显增高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。32h时,2.0%乙醇处理组中accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表达量分别为对照组的(4.4459±1.1233)、(3.7219±0.9065)、(4.1729±1.1271)和(3.9238±0.8222)倍,差异均具有统计学意义(P<0.05)。第二章异甘草酸镁对斑马鱼急性酒精性脂肪肝的药效观察1、异甘草酸镁对AFL斑马鱼肝脏形态的影响整体油红染色结果显示：与对照组相比,模型组斑马鱼肝脏明显肿大,肝内染色加深,有点状脂滴沉积；单纯给予MgIG (0.1mg/ml),斑马鱼肝脏形态正常；造模同时给予MgIG (0.1mg/ml)干预,干预组斑马鱼肝脏肿胀程度较模型组相比有所减轻。2、异甘草酸镁对AFL斑马鱼脂肪肝发生率的影响整体油红染色结果显示：与对照组相比,模型组脂肪肝发生率显著升高((63.33±0.06)%对比(36.67±0.08)%,P=0.002)；与模型组相比,中浓度MgIG (0.1mg/ml)干预组斑马鱼脂肪肝发生率显著下降((37.33±0.11)%对比(63.33±0.06)%,P=0.022)。而高浓度MgIG(1mg/ml)和低浓度MgIG(0.01mg/ml)干预后,斑马鱼脂肪肝发生率较模型组相比无统计学差异((65.00±0.15)%对比(63.33±0.06)%,P=0.861；(68.33±0.12)%对比(63.33±0.06)%,P=0.602)。由此可见,在造模同时给予MgIG (0.1mg/ml)干预可以有效降低斑马鱼脂肪肝发生率,高浓度组MgIG和低浓度组MgIG均不能发挥其保护作用。3、异甘草酸镁对AFL斑马鱼肝脏组织病理的影响光镜下观察肝脏病理组织改变情况,HE染色结果显示：对照组斑马鱼肝细胞结构正常,无脂质空泡；模型组斑马鱼肝组织形态学结构异常,肝细胞肿胀,可见弥漫性的脂质空泡,胞浆内挤满了微小脂泡；单纯给予MgIG (0.1mg/ml),斑马鱼肝组织结构正常；与模型组相比,造模同时给予MgIG (0.1mg/ml)干预后肝内无弥漫性脂质空泡形成,肝组织脂肪变性情况有所改善。第三章异甘草酸镁保肝作用机制的初步探讨1、异甘草酸镁对脂质代谢关键酶accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表达量的影响Real-time RT-PCR实验结果显示：与对照组相比,模型组accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表达量分别为对照组的(3.6372±1.4115),(3.3860±0.8487),(2.7270±1.3024)和(2.6209±2.1109)倍,表达水平显著升高,统计学差异显著(P<0.05); MgIG (0.1mg/ml)干预组accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA表达量分别为对照组的(0.4581±0.2532),(0.4905±0.3100),(1.7604±0.7372)和(1.2578±0.2471)倍。可见,与模型组相比,造模同时给予MgIG (0.1mg/ml)干预后能够显著下调accl, fasn, hmgcs和hmgcra mRNA的表达量,统计学差异显著(P<0.05)。2、异甘草酸镁对echs, mpt mRNA表达量的影响Real-time RT-PCR实验结果显示：①echs mRNA表达水平在对照组、模型组、MgIG给药组和MgIG干预组之间差异不大。模型组echs mRNA表达量为对照组的(0.7757±±0.0608)倍,表达水平有所下降。两组之间无统计学差异(P=0.102)；MgIG (0.1mg/ml)干预组echs mRNA表达量为对照组的(0.8734±±0.2879)倍。MgIG (0.1mg/ml)干预组echs mRNA表达量与模型组相比亦无统计学差异(P=0.445)。②模型组mpt mRNA表达量为对照组的(1.6899±0.4790)倍,表达水平显著升高。两组之间具有统计学差异(P=0.018); MgIG (0.1mg/ml)干预组mpt mRNA表达量为对照组的(0.6236±±0.0573)倍。可见,与模型组相比,造模同时给予MgIG (0.1mg/ml)干预能够下调mpt mRNA表达水平,两组间差异显著(P=0.002)。三.结论1、本研究通过直接在养鱼水中加入乙醇的方法成功地建立急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型。其最佳浓度和时间点为2.0%乙醇处理32h。此模型为进一步开展药效评估、药物筛选和机制研究奠定了实验基础。2、MgIG (0.1mg/ml)对急性酒精性脂肪肝具有保护作用,MgIG (1mg/ml)和MgIG (0.01mg/ml)均不能发挥其保护作用。MgIG可能通过对脂质代谢过程中关键基因的调节、纠正脂质代谢紊乱从而达到对肝脏的保护作用。3、斑马鱼是活体研究肝脏疾病、进行药物筛选的有效临床前模式生物,我们的研究为临床应用MgIG治疗酒精性肝病患者提供实验依据。