戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是无包膜的单股正链RNA病毒,主要经消化道传播引起急性戊型肝炎(hepatitis E, HE)。HE病死率高,在孕妇中可高达20%,慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝功能衰竭。此外,近年发现在器官移植和免疫缺陷患者中HE可以慢性化并导致肝纤维化。HE在发展中国家多见,但由于HEV的动物源性特点,近年在发达国家发病数也大幅增加。我国自2012年起连续3年戊型肝炎发病人数超过甲型肝炎发病人数,成为一个严重的公共卫生问题。因此,加强戊型肝炎疫苗的研发并及时推广应用对预防和控制戊型肝炎意义重大。根据HEV全基因序列的差异,世界各地的HEV毒株主要分为4个基因型。其中基因1、2型只感染人,与HE流行和爆发相关,基因3、4型既可感染人又可感染动物,提示HEV不同基因型毒株以及不同宿主来源的毒株具有不同的生物学特性,据此有人将HEV分成H型(Human)和Z型(Zonosis)。由于HEV难以培养,不能得到大量的病毒进行抗原结构的分析,因此只能用基因工程表达的HEV结构蛋白来代替。HEV的结构蛋白由其ORF2基因编码,聚合为病毒衣壳。多项研究表明,HEV ORF2基因编码蛋白C端2/3部分含有HEV优势抗原表位,包括能诱导免疫保护力的中和抗原表位,是HE疫苗研发的主要靶点。目前我国已有两种HE疫苗处于临床试验阶段或已上市,一种是由厦门大学利用大肠杆菌以包涵体形式表达的HEV 1型ORF2片断编码的重组蛋白p239 (aa368-606)已成功上市,成为全球首支上市的HE疫苗。另一种由我们实验室和长春生物制品研究所联合研发的利用大肠杆菌可溶性表达的HEV重组蛋白p179(aa452-630),能够诱导动物产生高滴度的特异性HEV中和抗体,最近已完成Ⅰ期临床试验。我们前期的研究发现HEVORF2基因编码蛋白C端452-617aa的重组蛋白(p166)含有HEV构型依赖性中和抗原表位,可定位于460-605aa,因此p166可作为包被抗原,应用间接法ELISA对HEV感染后血清、HEV疫苗p239和p179免疫后血清中的抗-HEV进行检测分析。当用不同基因型和亚型的p166抗原对HE病人和HEV实验感染动物血清进行抗体ELISA滴定时发现其敏感性不同,提示HEV感染后其血清中抗-HEV的产生具有一定的基因型特异性。但是不同基因来源的HEV疫苗免疫后血清中抗-HEV是否有差异,即不同基因型HEV疫苗是否存在免疫原性的差异至今一直未见报道。HE疫苗的免疫原性主要体现为疫苗免疫机体后血清中抗-HEV IgG的滴度高低。由于p239和p179两种HE疫苗来自HEV不同基因型,尤其是它们的片段大小各不一样,因此本论文通过间接法ELISA,分别应用等长片段的4种基因型p166作为包被抗原检测p239和p179疫苗免疫后小鼠、人血清以及基因1型和4型HEV毒株攻击后恒河猴血清中抗-HEVIgG,通过分析不同基因型p166抗原与血清样本中抗HEV IgG免疫反应的差异,对不同基因型HE疫苗p239和p179的免疫原性差异进行比较。另外,p166重组蛋白内还含有同时包含在p239和p179疫苗内的中和抗原表位,分别以基因1型和4型p166为免疫原制备鼠源单克隆抗体(McAbs),应用间接法ELISA、Western blot、体外中和试验以及建立竞争抑制ELISA鉴定所制备的McAbs的基因型特异性,来分析p239和p179免疫原性的基因型差异机制。旨在为安全高效HE疫苗的研制、HEV血清型分析、诊断试剂的开发提供科学依据。一、不同基因型戊型肝炎疫苗p239和p179的免疫原性差异首先以p239和p179疫苗各免疫6只Balb/c小鼠,每只10ug,定期采集小鼠血清,用4种基因型混合抗原p166mix (p166w01、p166Mex、p166US、p166Chn等量混合)作为包被抗原,检测抗-HEV IgG抗体,监测抗体的变化；继后再分别用4种基因型p166为包被抗原检测免疫后第20周小鼠血清中抗-HEV IgG;其次采集p239和p179疫苗3针免疫7个月后人血清,分别用4种基因型p166为包被抗原检测其与各血清样本中抗HEV-IgGo为了进一步分析天然HEV病毒颗粒是否同样存在免疫原性的基因型差异,分别用105病毒滴度的HEV 1型W01毒株和4型NJ703毒株静脉攻击恒河猴,定期采集猴血清,p166mix作为包被抗原检测恒河猴血清中抗-HEV IgG抗体,监测抗体的变化,再分别用4种基因型p166作为包被抗原,用间接ELISA检测攻毒后第12周恒河猴血清中抗-HEV IgG,研究血清中抗HEV IgG的基因型差异,以上所有检测血清样本均从1：2000开始倍比稀释至1：64000。通过分析血清中抗HEV IgG的基因型差异,比较不同基因型HE疫苗的免疫原性差异。结果如下：A. p166W01、p166Mex抗原与p239免疫后的小鼠血清中抗-HEV IgG的免疫反应明显高于p166US或p166Chn,但是p239免疫后小鼠血清抗HEV-IgG在抗原p166W01和p166Mex之间无显著性差异,在抗原p166US和p166Chn之间也无显著性差异；p166US、p166Chn与p179免疫后的小鼠血清抗HEV-IgG免疫反应明显高于p166W01或p166Mex,而免疫反应性在抗原p166US和p166Chn之间、p166W01和p166Mex之间同样未见明显差异。其中83%的p239免疫小鼠血清抗HEV-IgG免疫反应结果在抗原p166W01与p166Chn相比,其抗体滴度存在2倍或2倍以上差异,83%的p179免疫小鼠血清抗-HEV IgG在抗原p166W01和p166Chn之间的免疫反应显示抗体滴度存在2倍或2倍以上差异,其中4倍或以上滴度差异的均为33.3%。B.分别用等量4种基因型p166作为包被抗原检测p179疫苗和p239疫苗Ⅰ期临床试验3针免疫后7个月血清中抗-HEV IgG,并比较4种基因型p166在与不同疫苗免疫后血清ELISA反应的差异,p166W01和p166Mex与p239疫苗免疫血清抗-HEV IgG ELISA反应明显高于p166US或p166Chn,显示出统计学差异,而p166W01和p166Mex对血清中的抗-HEV IgG的检出未见显著性差异,抗原p166US和p166Chn对血清的抗-HEV IgG的检出结果无显著性差异；与此相反,p179疫苗免疫血清与抗原p166US和p166Chn的反应结果明显高于抗原p166W01或p166Mex。54%的p239疫苗和63%的p179免疫后血清在与基因1型p166抗原和基因4型p166抗原之间免疫反应的抗体滴度达到2倍或2倍以上滴度差异,其中4倍或以上滴度差异分别为：p239疫苗免疫后血清为20%,p179疫苗免疫后血清为26%。C.分别用等量的4种不同基因型p166检测W01和NJ703攻毒后8周恒河猴血清中的抗-HEV IgG抗体,W01、NJ703攻毒后恒河猴血清中抗HEV IgG与不同基因型p166免疫反应结果显示出明显的基因型差异,即W01攻击恒河猴血清与p166W01和p166Mex的免疫反应明显高于p166US或p166Chn,并具有统计学差异,NJ703攻击恒河猴血清与p166US、p166Chn的免疫反应明显高于p166W01或p166Mex。8份恒河猴HEV攻毒后血清在与基因1型p166抗原免疫反应性与4型p166抗原之间均存在4倍或4倍以上的滴度差异。以上结果表明,基因1型]HE Vp239疫苗和基因4型HEV p179疫苗免疫小鼠和人血清、基因1型HEV毒株W01和基因4型HEV毒株NJ703攻击恒河猴后在血清中产生的抗-HEV IgG均具有明显的基因型差异,反映出p239疫苗和p179疫苗以及天然HEV病毒颗粒均存在免疫原性的基因型差异,即基因1型HE p239疫苗和基因1型HEV病毒颗粒免疫血清中会产生基因1、2型特异性IgGs;而基因4型HE p179疫苗和基因4型HEV病毒颗粒免疫血清中会产生基因3、4型特异性IgGs。这些结果与HEV的H型和Z型分型相吻合。二、戊型肝炎疫苗基因型差异的机制探讨以上国内外首次发现的不同基因型HE疫苗p239和p179以及不同基因型HEV毒株W01和NJ703免疫原性的差异,推测其机制应该是抗原表位的差异,我们推测它们之间除了存在HEV共同抗原表位外还具有HEV基因型(1、2基因型和3、4基因型)的特异性抗原表位。免疫学中研究抗原表位最有效的工具和手段是McAbs。为此我们选择均包含在p239疫苗和p179疫苗内的并含有中和性抗原表位的p166为免疫原制备鼠源性McAbs。结果如下：A.以HEV第1基因型p166Sar(巴基斯坦株)为免疫原制备鼠源McAbs,采用间接ELISA法及免疫印迹法(Western blot)检测McAbs与4种基因型HEV ORF2重组蛋白p166W01、p166Mex、p166US和p166Chn的交叉反应性。用获得的McAbs细胞制备腹水,利用基于PCR的HEV体外中和试验,检测它们对基因1、2、3、4型人HEV的中和活性。结果如下：获得3株稳定分泌抗-p166 McAbs的杂交瘤细胞株,即3G1、4H4、2B1。其中3G1、4H4分泌的McAb与已知基因1、2、3、4型p166均结合；而2B1分泌的McAb只与1、2型p166特异结合,而不与已知基因3、4型p166结合。尤为重要的是,体外中和试验结果显示3G1分泌的McAb腹水可以同时中和4种基因型HEV,而2B1的McAb腹水只能中和1、2型HEV,不能中和3、4型HEV。B.以HEV第4基因型p166Chn(中国株)为免疫原制备鼠源单克隆抗体(McAbs),采用间接ELISA法及免疫印迹法(Western blot)检测McAbs与已知基因型HEV ORF2重组蛋白p166W01、p166Mex、p166US和p166Chn的交叉反应性。用获得的McAbs细胞制备腹水,利用基于PCR的HEV体外中和试验,检测它们对基因1-4型HEV的中和活性。结果如下：获得3株稳定分泌抗-p166 McAbs的杂交瘤细胞株,即5G5、6A1、4C5。其中5G5、6A1分泌的McAb与已知基因1、2、3、4型p166均结合；而4C5分泌的McAb只与3、4型p166特异结合,而不与已知基因1、2型p166结合。尤为重要的是,5G5分泌的McAb腹水同时能中和1、2、3、4型HEV,而4C5的McAbs腹水只能中和3、4型HEV,不能中和1、2型HEV。C.分别将针对p166Sar的鼠源性中和性McAbs 2B1、3G1, p166Chn免疫小鼠获得的中和性McAbs 4C5、5G5,进行纯化以及辣根过氧化物酶标记(HRP),分别用基因1型p166W01和基因4型p166Chn作为包被抗原,并通过方阵滴定确定包被抗原和酶标单抗的最佳稀释度,建立竞争抑制ELISA,通过检测不同单抗之间是否能够竞争与同一抗原结合,判断其是否作用于同一抗原表位,进一步判断疫苗上抗原表位的异同。结果：McAb 3G1与McAb 5G5均不能抑制HRP-2B1与包被抗原p166W01的结合,说明McAb 3G1和McAb2B1在第1基因型重组蛋白p166W01上所对应的抗原表位不同。而McAb 3G1与McAb5G5可相互竞争与包被抗原p166W01结合,说明来源于基因1型p166的McAb 3G1与来源于基因4型p166的McAb 5G5作用于同一抗原表位,即第1基因型重组蛋白p166存在共同型中和抗原表位以及第1、2型特异性中和性的抗原表位。而McAb 3G1、5G5与4C5之间的竞争抑制结果显示：McAb 3G1与McAb 5G5不能抑制]3RP-4C5与包被抗原p166Chn的结合,同样说明p166Chn存在4种基因型共同型中和抗原表位以及第3、4基因型特异性中和性抗原表位。以上结果提示HEV ORF2重组蛋白p166既含有不同基因型HEV共同的中和抗原表位,也含有基因1、2型特异性、基因3、4型特异性的中和抗原表位,具有不同的抗原特征。由于HE疫苗p239和p179均含有p166抗原片段,p166抗原表位的基因型差异完全可以解释p239和p179疫苗免疫原性的基因型差异,甚至也可以解释不同基因型HEV毒株感染猴血清与不同基因型p166抗原反应性的差异。HEV基因型特异性中和抗原表位不仅仅存在于基因工程表达的抗原蛋白上,而且也存在于天然的HEV病毒颗粒上。本研究就HE疫苗p239和p179的免疫原性差异及其机制开展了系统的研究,揭示了上述新的现象和内在关系,相信这些新的发现必将丰富HEV的研究成果,会对HEV的生物学特性、HE疫苗的研制、疫苗p239和p179的应用、HEV血清学分型、诊断试剂的开发提供有益的帮助。