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研究背景及目的智力发育迟滞(Mental Retardation),也称为智力落后或精神发育不全,是小儿常见的一种发育障碍。E3泛素连接酶的底物受体Cereblon(CRBN),与智力发育迟滞疾病有关。通过对一组家族性的智力发育迟滞患病儿童的基因组测序筛查及多样性分析,发现患者的CRBN存在一种无义突变,该突变是在氨基酸的419位精氨酸处提前引入了一个终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,使之在羧基端失去24个氨基酸,产生了突变体蛋白,称为CRBNR419X(c.1255 C>T);另外,一项最新研究发现,CRBN的391位突变体C391R(c.1171 T>C)可以导致智力发育障碍。然而,CRBN突变如何引发智力发育迟滞的分子机制,一直以来都还不清楚。本实验室前期的质谱数据结果表明,髓鞘抑制因子NogoA可能是CRBN的下调蛋白之一。而Nogo A和神经发育密切相关。据此信息,我们推测CRBN是否通过NogoA来影响神经发育。研究方法1)在HEK293T细胞中过表达CRBN与Nogo A,通过免疫沉淀纯化CRBN,再通过蛋白质印迹检测NogoA;并用proteinA/G免疫沉淀纯化内源性NogoA,通过蛋白质印迹验证其与CRBN的相互作用;2)用蛋白酶体抑制剂(MG132)处理HEK293T细胞,并通过亲和纯化方法纯化NogoA,检测其泛素化水平,探究CRBN是否通过影响Nogo A的泛素化降解途径调控Nogo A的蛋白水平;3)用放线菌酮(CHX)在HEK293T细胞中抑制蛋白质合成,通过免疫印迹方法检测在CHX处理不同时间点CRBN对Nogo A的蛋白水平的影响,从而探索CRBN对Nogo A的降解及半衰期的影响;4)通过过表达CRBN及敲低CRBN后刺激小鼠神经瘤母细胞N2a分化实验,研究CRBN是否通过Nogo A影响N2a细胞神经突起的生长;5)通过慢病毒包装技术,在N2a细胞中稳定过表达CRBN及其突变体。研究结果1)CRBN与NogoA存在相互作用;2)CRBN可以通过改变Nogo A的泛素化降解水平调控其蛋白水平,而C391R不再调控NogoA的泛素化;3)CRBN可以显著缩短Nogo A的半衰期,降低Nogo A的稳定性;4)CRBN过表达刺激N2a细胞突起的生长,而Nogo A敲低后此现象消失;5)Nogo A敲低抑制CRBN对N2a突起长度的调节作用。研究结论CRBN作为E3泛素连接酶底物受体,通过调控Nogo A蛋白的泛素化降解途径调节其蛋白含量及稳定性,进而影响神经突起的生长。本研究第一次在分子水平上阐明了 CRBN通过调控NogoA蛋白水平对神经突起生长的调控关系,为智力发育迟滞的发病机制的进一步研究及临床治疗提供了重要的理论依据。