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本文组合应用色谱、质谱、光谱等测试技术,系统地研究了两个极具开发价值的水解体系:牛血红蛋白—胃蛋白酶(体系I)、牛乳酪蛋白—胰酶(体系II),并基于酶学性质和蛋白质结构知识,剖析酶解历程动态特性和多肽释放规律。1.比较体系I在两种不同水解机制下的反应行为。在pH为4.5时,牛血红蛋白保持天然结构,在胃蛋白酶作用下发生顺次水解,底物在反应过程中始终存在;在pH为2.0时,变性的牛血红蛋白在胃蛋白酶作用下发生拉链水解,底物在反应过程中快速转化为中间多肽。胃蛋白酶主要攻击α链全链和β链两端区域,而β链中部区域由于高亲水性而少有剪切。基于多肽释放动力学规律,确定活性多肽最佳制备工艺。进一步根据胃蛋白酶水解特性和牛血红蛋白结构剖析了反应行为。2.跟踪体系I活性多肽相互转化历程。在抗菌肽α107-136向血管舒缓激肽α110-125转化历程中,共涉及6个相关多肽;基于序列分析和多肽释放动力学,构建了反应网络,分析胃蛋白酶对各种肽键的亲和力;依据结构分析推断多肽生物学功能。3.利用反相色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱对体系II酶解产物多肽进行分离。在酶解历程中,产物多肽整体上按疏水性向亲水性、多电荷向寡电荷、高分子量向低分子量转变。4.体系II的底物和产物分析。酪蛋白在胰酶作用下,胶束含量逐渐降低,但胶束尺寸和分子量却在水解10min内不断增加。反应24小时内,共释放297个多肽。胰酶攻击单体的速度从快到慢为:β-酪蛋白>αs1-酪蛋白>αs2-酪蛋白>κ-酪蛋白。5.体系II酶解历程的理论模拟和直观表征。利用2-30-30-1的BP模型对酪蛋白酶解历程分子量分布进行模拟;基于该模型完成三维图形表征,可直观分析胶束区、单体区、巨肽区、长肽区和寡肽区的含量变化。6.酪蛋白磷酸肽的特殊鉴定和释放规律。采用液质联用技术结合中性丢失扫描(SALSA自定义检索模块)和数据库搜索(Sequest蛋白数据库匹对)对酪蛋白磷酸肽(CPPs)进行鉴定;CPPs在串联质谱过程均发生明显的中性丢失现象,利用中性丢失峰,可迅速判断其价态、分子量和磷酸化个数;跟踪了CPPs的释放规律,确定了其最佳制备工艺。7.多肽反相色谱保留行为模型构建及磷酸化影响规律研究。基于365个非磷酸肽,构建了色谱保留时间预测模型;单一和多重磷酸化分别导致多肽整体亲水性的降低和增强,因此分别比非磷酸化对应体较晚和较早洗脱。