甜瓜属人工异源四倍体(Cucumis × hytvJ.F.Chen&J.H.Kirkbr,2n = 4x = 38)(简称“新种”)是栽培黄瓜’北京截头’(C.sativus,父本,2n = 2x=14)和黄瓜近缘野生种酸黄瓜(C.hystrix,母本,2n = 2x = 24)经过有性杂交、胚拯救和染色体加倍创制的新物种。该异源四倍体具有一个明显有别于二倍体亲本的新表型,即在同等栽培条件下,其幼叶表现出明显的黄化现象,随着植株的生长可逐渐恢复至绿色,且该性状在自交后代中可稳定遗传。针对该叶色变异现象,本文对新种及其双亲进行了如下两方面的研究:一方面为表型和光合特性的比较研究,包括新种及其双亲的生长发育状态、光合色素含量、光合特性各项参数和叶绿体超微结构观察;另一方面为叶绿素生物合成代谢分析,研究了叶绿素生物合成途径的中间代谢产物含量变化以及关键酶基因的表达水平和基因序列差异,初步探讨新种幼叶黄叶产生原因,分析异源多倍化对新种表型和基因产生的影响,为揭示新种幼叶黄化机制提供参考。具体研究内容和结果如下:1.新种以及双亲的生长发育和光合特性比较分析与双亲相比,新种黄化幼叶中的叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)和总叶绿素(Chl)含量均显著降低,成熟功能叶中恢复至正常水平,与叶色表型一致,表明新种幼叶黄化是由叶绿素含量降低引起的。植株叶面积、干物质含量以及种子重量和大小的测定结果显示,新种生长发育各项指标均介于其双亲之间,并偏父性遗传,说明叶绿素缺乏症状并没有阻碍新种的生长发育。同样,净光合速率、PSII最大光学效率和ΦPSII实际光学效率等光合特性的测定结果均显示,新种的各项光合参数指标都介于其双亲之间并表现为偏父性,说明新种的叶绿素缺乏症状并未对其光合作用造成显著影响。叶绿体超微结构观察结果表明,新种黄化幼叶中叶绿体的类囊体膜结构异常,基粒垛叠片层松散,数目明显减少,且排列不规则;而复绿功能叶则有所恢复。由此推测,叶绿素缺乏可能与叶绿体结构的紊乱有关。2.新种及双亲叶绿素生物合成代谢分析叶绿素生物合成中间代谢产物含量测定结果显示,与双亲相比,新种黄化幼叶的Corogen Ⅲ相对含量迅速下降,并导致下游各中间产物Proto Ⅸ、Mg-Proto Ⅸ和Pchlide含量都显著减少,而上游前体物质ALA、PBG和Urogen Ⅲ积累。成熟功能叶中CorogenⅢ含量和下游中间产物含量相比幼叶则有所升高,与双亲无显著差异。因此推测受阻步骤可能在 Urogen Ⅲ→Corogen Ⅲ。通过对叶绿素生物合成途径中的19个关键酶基因进行荧光定量表达分析,结果表明,POR、HEMA1和HEME2三个基因在新种黄化幼叶中表达水平显著低于双亲,而其它的16个基因与双亲无显著差异,其中HEME2是控制Corogen Ⅲ合成的催化酶基因。因此推测,新种幼叶的黄化与叶绿素生物合成酶基因的表达下调密切相关。3.新种及双亲中POR、HEMA1和HEME2基因的克隆采用同源克隆技术分别从酸黄瓜、栽培黄瓜和新种中克隆了 POR、HEMA1和HEME2三个叶绿素生物合成途径的关键酶基因,序列分析结果表明,酸黄瓜POR基因开放阅读框长1199 bp,编码399个氨基酸,与栽培黄瓜POR基因相比,存在14个碱基位点和1个氨基酸位点的差异;酸黄瓜HEMA1基因开放阅读框长1659 bp,编码552个氨基酸,与栽培黄瓜HEMA1相比具有25个碱基位点和3个氨基酸位点的差异;酸黄瓜HEME2基因开放阅读框长1179 bp,编码392个氨基酸,与栽培黄瓜HEME2仅有6个碱基位点差异,氨基酸序列则完全一致。而新种中可克隆出两条分别与酸黄瓜和栽培黄瓜碱基序列相一致的基因序列。序列比对分析结果表明,基因序列在异源多倍化过程中并没有发生碱基突变,然而存在明显的基因重组现象。因此推测,叶绿素合成关键酶基因在异源多倍化过程中虽未发生碱基突变,然而不同碱基序列的基因重组可能对基因表达产生了一定影响。