胆管癌是一种具有很高侵袭性的肿瘤,而且具有非常差的预后。它的临床表现具有隐匿性、早期即发生周围浸润及远处转移。近年来,胆管癌的发病率及死亡率逐步上升。从解剖学上来讲,胆管癌可以分为肝内胆管癌及肝外胆管癌：而肝外胆管癌又可以分为肝门胆管癌及远端胆管癌。手术切除(包括肝部分切除或者肝移植)是唯一有效的根治方法。然而,因为肿瘤局部侵袭和早期器官远处转移的特性以及通常剩余肝脏的功能不足以满足患者生存需要等条件的制约,只有少数病人能够进行根治性手术。但即使进行根治切除术后仍有很高的复发率；此外,辅助治疗(包括化疗和放射治疗)的治疗效果很差,而并不能有效的减少肿瘤复发的风险。以上原因造成了胆管癌的治疗和预后较差。目前用于胆管癌早期诊断及预后评估的、理想的、具有高敏感性及特异性的标志物尚未发现或筛选出来。因此,阐明胆管癌发病及恶性行为的分子生物学机制,有助于发现和筛选特异性的分子靶点,对其早期发现、早期诊断、早期干预治疗和患者预后评估具有重要意义。EGFR和HER2是是络氨酸激酶生长因子受体(TKGFRs)家族中的一员,他们有接近50%的同源性,在细胞生长、增殖信号传递中起重要作用。在胆管癌中,EGFR和HER2曾被认为是重要的预后因子和潜在的治疗胆管癌的重要靶点。直到今天,虽然有很多关于他们的增殖、基因变异等方面的研究,但EGFR高表达在胆管癌分子生物学中的具体机制仍不明确。SOX4(sex-determining region Y-box4)是SOX家族中的一员,已经被证实了它在细胞凋亡中起重要的作用,它在很多恶性肿瘤有广泛的表达,如在白血病、乳腺癌、肝癌、肺癌及前列腺癌等均有表达。如果下调SOX4在上述肿瘤中的表达,通过影响EMT可以降低肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力。尽管已经有很多关于SOX4的研究,但是其具体的机制仍不明确。在我们的研究中,我们系统性的检测了SOX4、EGFR和HER2在胆管癌中的表达。我们首次揭示了SOX4是影响肝内胆管癌预后的独立因素,并且提出了SOX4的表达与EGFR的表达密切相关,证实了EGFR+和SOX4+的表达预示了更差的预后。在后续试验中,我们进一步发现SOX4基因的siRNA干扰能有效抑制胆管癌细胞RBE增殖、转移、侵袭能力；siRNA沉寂SOX4可以显著降低EGFR蛋白在RBE细胞中的表达水平,证明SOX4可能是EGFR在体外胆管癌细胞表达的一种调节机制：在体外实验中我们还证实SOX4基因的siRNA干扰能影响EMT的表达,表明SOX4是胆管癌EMT的一个重要的诱导因子。第一部分胆管癌中SOX4的表达及临床意义的研究目的：系统检测SOX4在胆管癌中的表达,探讨SOX4和临床病理特征的联系以及与胆管癌患者预后的关系。方法：1.建立胆管癌患者数据库,构建胆管癌肿瘤组织芯片选取山东大学齐鲁医院、济南市中心医院及聊城市人民医院2005年1月-2009年12月胆管癌手术病例152例,采集患者性别、年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、手术方式等临床信息及随访记录建立胆管癌患者数据库。选择相应患者病理组织标本,构建胆管癌组织芯片。2.应用免疫组织化学方法检测SOX4.EGFR和HERB2在胆管癌中的表达,分析各成员表达的内在联系及与临床病理特征的关系。3.SOX4在胆管癌中预后意义的分析采用Kaplan-Meier(K-M)法和COX回归对SOX4家族成员的表达与胆管癌患者预后的关系进行单因素和多因素分析。结果：1.成功建立了152例胆管癌患者信息资料库,并对其中121例患者进行了成功随访；并以病理标本为基础制作了胆管癌肿瘤组织高通量组织芯片。2.SOX4在胆管癌中的表达和临床病理联系SOX4和EGFR在肝内胆管癌中的表达率分别为：29.3%、(17/58)和22.4%(13/58)； SOX4和EGFR在肝外胆管癌中的表达率分别为29.7%(28/94)和35.1%(33/94)。其中比较有意义的是SOX4在肝内胆管癌中的表达更多见于年老的病人(P=0.009)。同样的是,SOX4的高表达与更差的病理分型、性别及UICC分期有轻度关联,分别为P=0.061、P=0.078和P=0.089；但与肿瘤的大小、T分期或淋巴结转移无关,分别为P=0.758、P=0.753和P=0.494。而在肝外胆管癌中,未发现SOX4的表达与临床病理指标有关。EGFR表达在肝内胆管癌及肝外胆管癌中,分别为13/58(22.4%)和33/94(35.1%)。EGFR的高表达在老年肝外胆管癌的患者中具有显著意义(P=0.045)。EGFR的高表达预示着更差的病理分型,在肝内胆管癌及肝外胆管癌中,分别为(P=0.031)和(P=0.012).在我们的研究中未发现其他病理指标具有意义为了进一步研究SOX4表达对胆管癌病人预后的影响,我们将肝内、外胆管癌的总生存率进行了单因素和多因素分析。其中肝内胆管癌中SOX4阳性组病人死亡率明显高于SOX4阴性组病人(P=0.038)。采用Kaplan-Meier模型分析SOX4与预后的关系证实肝内胆管癌中SOX4表达阳性的病人与癌症造成的死亡密切相关(见图2)。然而,在我们的研究中发现,肝外胆管癌SOX4高表达的病人与其生存率并没有统计学意义。为了进一步更准确的判断患者生存和各临床病理特征因素的关系,我们应用单因素和多因素Cox比例风险模型来分析预后因素。单因素分析中发现肝内胆管癌中SOX4过表达是有意义的指标(hazard ratio=2.35,95％CI=1.104-5.786,P=0.029)(见图4)。在多因素分析中发现淋巴结转移、EGFR高表达具有统计学意义,而SOX4的高表达没有意义。在肝外胆管癌SOX4的高表达对胆管癌病人的生存率没有意义,在单因素分析中证实包括EGFR过量表达在内的三个指标是影响预后的指标。在多因素分析中(见图5)只有UICC分期被认为是独立的影响预后的指标(P<0.01)。综上所述,SOX4对肝外胆管癌来说可能不是一个令人满意的指标。结论：本部分中我们检测了SOX4在肝内和肝外胆管癌中的表达情况,证实了SOX4在胆管癌中的高表达与EGFR密切相关,还发现了EGFR和SOX4同时表达的患者具有更差的预后。第二部分SOX4对胆管癌细胞功能的影响和机制研究目的：本部分中研究了siRNA干扰对SOX4对胆管癌细胞株增殖、迁移和浸润能力等的影响,并探讨其发挥影响作用的可能机制。方法：1.采用PCR等方法,克隆了人SOX4的基因cDNA片段,将其插入pcDNA3.1真核载体,成功构建了SOX4的过表达质粒并将其转入胆管癌RBE细胞；针对SOX4基因设计并合成了siRNA干扰片段并将成功其转染入胆管癌RBE细胞。2.培养肝内胆管癌RBE细胞株并分组：NC组和siRNA-SOX4(Lipofectamine+siRNA-SOX4)组。培养RBE细胞,接种于96孔板中分别于Oh、24h、48h、72h时间点用MTS法检测各组细胞增殖率。用siRNA-SOX4及NC处理RBE细胞,取24h后的RBE转移至Transwell小室中培养6h,分别计数并比较SOX4干扰与对照照组穿过基底膜的RBE细胞数目。3.通过RT-PCR和Western blotting法分别检测SOX4-siRNA转染后胆管癌RBE细胞中SOX4、EGFR和蛋白的表达水平。4.分别采用Transwell侵袭实验,MMT法和检测SOX4-siRNA转染后胆管癌RBE细胞侵袭、转移和增殖的能力的情况。5.为了进一步验证SOX4是否是胆管癌的EMT,通过RT-PCR和Western blotting法分别检测SOX4-siRNA转染后胆管癌RBE细胞中上皮细胞marker(E-cadherin和β-catenin)和间质细胞marker (Vimentin和N-cadherin)的表达情况。结果：siRNA干扰SOX4可以显著降低EGFR蛋白在RBE细胞中的表达水平。相反的是向RBE细胞转染SOX4质粒后能提高EGFR在RBE细胞中的表达水平。有意义的是,上述干扰操作并不能改变磷酸化EGFR的蛋白表达水平。总结上述数据我可以得出,SOX4可能是EGFR在体外胆管癌细胞表达的一种调节机制。划痕实验结果显示48h时siRNA-SOX4组划痕较NC组愈合明显。说明siRNA沉寂SOX4可以抑制胆管癌细胞的侵袭能力。为了进一步验证SOX4是否是胆管癌的EMT,我们检测了siRNA沉寂SOX4后的上皮细胞markers(E-cadherin和β-catenin)和间质细胞markers(Vimentin和N-cadherin)。结果显示E-cadherin和β-catenin的表达明显下降,而Fibronectin and N-cadherin的表达则明显上调。结论：1.在体外试验中,SOX4基因的siRNA干扰能有效抑制胆管癌细胞RBE增殖、转移、侵袭能力。2.在体外实验中,siRNA沉寂SOX4可以显著降低EGFR蛋白在RBE细胞中的表达水平,SOX4可能是EGFR在体外胆管癌细胞表达的一种调节机制,但其具体机制仍需要进一步研究3.在体外实验中进一步证实SOX4基因的siRNA干扰能影响EMT的表达,表明SOX4是胆管癌EMT的一个重要的诱导因子