研究背景目前,种植体植入后愈合时间较长,骨结合率仍然很低,增加了种植体长期稳定的风险。种植体植入体内后大约需要6-12周的时间才能够进行临床负重,较长的修复周期在一定程度上限制了种植修复的临床应用。研究表明,在种植体早期愈合过程中种植失败的风险最大。愈合的时间越长,种植失败的各种风险就会越高。因此更快更好的骨结合是临床医生和广大患者所追求和期待的目标。研究表明,钛表面生物活性随着储存时间的增加而降低的情况,即钛表面生物活性出现的老化现象。经过喷砂酸蚀表面处理制备完成的种植体置于空气中干燥会由相对亲水性变成疏水性。种植体的表面活性的影响因素包括：种植体的表面形貌、分子结构、元素组成、表面自由能、亲疏水性、电荷状态等。大量研究资料显示,疏水性的种植体表面将减少蛋白吸附,同时润湿性差也会影响材料表面接触机体血液成分的初始状态及其细胞反应,从而影响种植体生物活性的发挥,甚至可以影响到骨结合的长期效果。研究表明,由于储存时间较长而老化的种植体经过紫外线辐照后,种植体表面活性可以提高,使表面自由能增强并获得亲水特性,同时促进蛋白的吸附、成骨细胞粘附、增殖和分化,甚至能够促进骨结合,显示出了种植体良好的生物相容性。本课题组前期通过紫外线光催化技术处理纯钛表面并进行理化分析以及细胞学实验,成功获得了具有高表面能及生物活性的表面。处理后的钛表面能够促进MG63成骨细胞的粘附、增殖、分化和矿化。但是这些处理后的钛表面经过一段时间的储存后,这种良好的效应逐渐消失。经过其他途径处理的钛种植体表面获得高表面能和高生物活性后,随着储存时间的增加表面能和表面活性逐渐降低,这表明钛表面的生物活性具有一定的时效性,老化现象普遍存在。而导致这种老化显现的原因还不明确。最近大量研究表明,纯钛表面在空气中极短时间内就会吸附空气中无机离子和有机碳氢化合物以及一些杂质,从而造成种植体表面的污染,使种植体表面发生“老化”现象。老化受污染的纯钛表面生物学活性较新制备的纯钛要低,这种受污染的纯钛表面可以改变表面化学组成和表面能,从而影响早期蛋白和细胞在表面的粘附、增殖和分化,最终影响骨整合的建立。大量的研究表明,种植体植入后与骨组织之间形成骨结合的速度和强度与植体表面的生物活性密切相关。种植体植入机体后,植体与骨组织间有两种愈合形式：距离成骨和接触成骨。距离成骨是指新生骨从原有的骨壁向种植体方向生长,最后与种植体表面附着产生骨结合。接触成骨是指成骨细胞直接在种植体表面沉积、增殖,与原骨壁周围骨细胞形成新骨网,是一种双向成骨模式。研究表明：接触成骨的骨形成速度较距离成骨的成骨速度快30%。接触成骨在植体表面形成的编织骨有利于增加种植体初期稳定性。因此,老化受污染的纯钛表面不利于接触成骨的发生,不利于新生骨组织在植体周围形成,使种植失败风险增大。种植体制备过程较复杂,从最初的钛材料到最后成为商品,中间要经历众多繁琐的程序,包括机床加工,种植体表面处理,清洗,消毒杀菌,包装储存等等,制备和储存的过程中难免与空气接触。目前种植体常规的储存方式为常温常压保存于密封小瓶里,可以长时间接触空气,那么表面处理完成的种植体,在这种常规储存模式下是否会继续受到空气的污染而继续产生老化呢?对于这方面的研究目前为止还未见报道。因此基于这些考虑,小心的隔绝空气与种植体的接触,避免表面受到空气的再污染造成表面化学结构的继续改变是非常有必要的。避免经过表面处理的种植体表面的再污染是否有利于种植体周围早期新骨的形成?是否更利于种植体的骨结合?这些仍需要进行对比研究。惰性气体在常温常压都是无色无味的单原子气体,它们的最外电子层的电子已“满”,所以它们非常稳定,极少进行化学反应。氩气作为一种惰性气体的化学性质很不活泼,常用做工业生产中的保护气。如金属焊接时用氩气保护隔绝空气污染,防止高温下金属和空气中的氧气等发生反应。研究证明在氩气保护下对纯钛表面进行等离子喷涂,有效的隔绝空气中杂质的污染,保持了纯钛表面高表面能,还可以大大地降低表面碳氢化合物的吸附,促进种植体周围早期的骨形成。纯钛种植体表面处理技术的研究在过去的几十年成为一大热点：如喷砂酸蚀、钛浆涂层、羟基磷灰石涂层、微弧氧化、激光处理等。其中喷砂酸蚀已成为国际上使用最为广泛的种植体表面处理之一,是被研究得最多的一种表面处理方法。无论从其粗糙度、表面形貌还是骨引导性和生物相容性方面,都有许多的研究报道,喷砂酸蚀处理的表面具有良好的机械特性和生物相容性已经得到了公认,已经成为一种比较成熟的表面处理方法。本文旨在以喷砂酸蚀纯钛表面为基础,研究在氩气保护下制备出的纯钛种植体是否可以有效地减少与空气的接触,隔绝空气的污染,从而使钛种植体保持高表面能和表面活性,促进种植体周围早期成骨,高效、快速的建立骨整合,最终顺利度过植入后2-4周相对风险较高的危险期,提高种植成功率。研究目的1、探讨隔绝空气对纯钛种植体表面的再污染对其理化性质的影响2、探讨隔绝空气对纯钛种植体表面的再污染对其表面生物活性及早期成骨效应的影响研究方祛1.样本的制备及分组将进口四级纯钛通过数控机床切割成直径15mm,厚度1.0mm的钛片和圆柱状钛种植体(有效长度为6mm,直径3.5mm,螺纹深度0.75mm)。用碳化硅磨砂纸400#,800#,1000#,1200#依次打磨钛片,然后用丙酮、无水乙醇和去离子水依次清洗各2次,每次15分钟。继而用120μm直径氧化铝颗粒垂直样本进行高压喷砂,进一步用18%盐酸和49%硫酸在60℃下对样本进行酸蚀30分钟。分组：分别在空气和氩气保护下对钛片和钛种植体依次用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗各2次,每次15分钟,对照组保存在密封小瓶,实验组保存在充满氩气的密封小瓶中,以25 kGy的Y射线进行消毒12h后储存,从而制备出对照组和氩气保护组样本,样本制备后3天和2周用于检测或动物实验。2.钛片表面理化性能的检测：用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM),观察钛片表面形貌。用表面接触角测量仪,测量1μl水滴于钛片表面的接触角大小。采用表面形貌仪测量表面粗糙度。用X射线光电子能谱仪在高真空状态下(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)检测氩气保护下钛片表面化学结构组成,以评估两组间钛片表面理化性能及差异。3.动物实验：1)实验动物及分组情况：成年雄性健康的Beagle犬共4只,15个月龄,体重为15±0.2kg。按随机分配的原则,将4只成年雄性健康Beagle犬分为2周组和4周组,每组各2只。分别在其后腿胫骨上段植入这两种表面处理的植体,采用左右两侧胫骨对照设计,每侧beagle犬胫骨植入6枚种植体,自近心端至远心端编号为1-6,每一种处理的植体各三枚。每一条beagle犬胫骨植入种植体12枚种植体,4只beagle犬共植入48枚种植体。其中空气暴露处理组和氩气保护处理组各有24枚种植体样本。2)种植体植入：Beagle犬术前12小时禁饮食,术前半小时肌注青霉素钠40万u,以速眠新0.2 ml/kg和戊巴比妥钠0.5 ml/kg行肌肉注射全身麻醉。麻醉生效后实验动物仰卧位,固定后术区脱毛、消毒、铺巾。沿胫骨表面切开皮肤、皮下组织、骨膜,剥离暴露胫骨干骺端,于干骺端远心端约2cm-8cm范围,以种植体间距1cm备种植窝。植入种植体,种植窝大小与种植体完全一致,使种植体外侧螺纹贴着制备的种植窝骨壁。植入完成后,术区分层对位缝合创口。术后肌肉注射庆大霉素80mg/d预防感染,共注射5d。3)荧光双标记法：4只实验用Beagle犬均将骨荧光标记物四环素于处死前第14、13天以25mg/ml注射,钙黄绿素于处死前第4、3天以5mg/ml注射。每天注射一次,连续注射两天。4)实验样本的处理：分别于2和4周时间点对实验动物以过量的麻醉药致死,将带有种植体段的胫骨取下,清洗、去除软组织后以10%福尔马林固定。固定完全后用梯度酒精脱水,最后用树脂包埋。5)实验样本的检测：标本用硬组织切片机以近远中方向切成150μm左右厚度硬组织切片,然后打磨抛光至30μm左右,用荧光显微镜观察并拍摄组织切片,随后用甲苯胺蓝染色,用光学显微镜观察拍摄组织切片,最后用图像分析软件定量分析种植体-骨接触(Bone-implant contact, BIC)和新生骨面积(Bone area, BA)。BIC测量以每个骨环直接与种植体接触的骨长度/骨环总长度计算×100%,BA测量以每个骨环内新生骨面积/梯形骨环总面积×100%。扭出力矩实验用扭出仪器进行测量,种植体松动的一瞬间力矩值为扭出力矩值,记录用于统计分析,反应种植体骨结合强度。统计分析所有数据以平均值x±s标准差表示,假设检验为双侧检验。用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析,如涉及分组和时间两个处理因素,先用析因设计进行分析是否存在交互效应。进一步采用两独立样本t检验方法进行统计学分析。如只有分组一个处理因素时,直接采用两独立样本t检验方法进行统计学分析。检验水准α=0.05,P<0.05时各组间差异具有统计学意义。实验结果1.表面形貌和表面亲水性氩气保护下制备组钛片和空气暴露制备组钛片表面形貌大致一样,没有差异,均为表面均匀一致的微纳米孔隙。两组钛片表面粗糙度相似,差异无统计学意义(t=-0.232,P=0.821)。空气中和氩气保护条件下立刻制备的钛片亲水性均较好,1 μl ddH20在两组实验钛片表面的静态水接触角都基本为0℃℃。随着3 d、2 w时间的延长,两组钛片表面亲水性均有不同程度下降,相对于暴露在空气中组,氩气保护下钛片表面在两个时间点3d(t=20.328,P=0.000)和2 w(t=23.494,P=0.000)亲水性下降较小2.表面化学结构组成X射线光电子能谱分析(保存3d和2w值)两组钛片样本表面含有化学元素大致一样,均含有Ti、C、O、Al、N等元素。其中,相对于空气暴露组C(43.6%)、Ti(17.8%)、O(32.5%),实验组C(24.3%)有明显的下降,Ti(29.5%)和O(38.3%)有一定的上升,说明一方面氩气保护组可以很好隔绝空气中的含碳气体和其它有机吸附物,另一方面,氩气并不会被吸附到钛片表面,造成污染。从化学组成结构上看,相对于空气暴露组,C元素结合能在284.8 eV和286.4 eV处均有不同程度下降,而284.8 eV结合能峰属于C-C, C-H,主要来自于空气中的碳氢化合物,286.4 eV结合能峰属于C-O,主要是空气中的有机吸附物。说明了钛片在空气中随着时间的延长会不断与空气接触,会吸附空气中的污染物,而氩气保护下则可以很好的隔绝空气,避免造成物理吸附的污染。3.种植体-骨整合程度测量按照种植体植入模式所示于比格犬胫骨干骺端远心端2cm处开始植入种植体,种植体间距为1cm,近心端4枚植体用于后期作硬组织切片计算BIC,远心端2枚植体用于后期评估种植体扭出力矩。前期实验解剖比格犬胫骨得知胫骨干骺端远心端约2cm-9cm由较均匀一致的外层皮质骨和中央髓腔构成。硬组织荧光磨片中可见有两种荧光显示,为黄色和绿色,分别为四环素和钙黄绿素的颜色。通过实验观察,黄色较绿色略弱,分析可能四环素注射时间较长有一定的代谢,而且绿光遮蔽黄色所造成。另外,在切片中发现无论是对照组还是实验组骨髓腔中仅有微量的骨形成,因此本实验中BIC以皮质骨区成骨情况进行组间比较。在甲苯胺蓝染色的硬组织切片中,可见骨环中新生的骨组织染为淡蓝色,另外见到成骨细胞和类骨质成分。相对于对照组,实验组骨环中成骨效果较好,有大量的新骨形成,而且骨小梁较粗大。经统计学分析,2 w和4 w时实验组种植体骨接触面积BIC分别为34.26±5.08%和50.81±7.05%,均显著大于对照组2 w(t=-5.653, P=0.000),4 w (t=-6.008, P=0.000)。2 w和4 w时实验组种植体骨接触面积BA分别为20.06±4.94%和34.22±4.33%,均显著大于对照组2w (t=-3.618, P=0.004),4 w (t=-3.516,P=0.001)。实验组扭出力矩值显著高于对照组2 w(t=-3.912,P=0.008)和4 w(t=-2.583,P=0.042)。结论1.种植体常规制备后表面不可避免的会被空气中的有机物或杂质所污染,导致表面生物活性降低。2.常规经过表面处理的钛种植体隔绝空气保存不会对种植体表面形貌造成影响。3.氩气保护下的经过常规处理制备完成的钛种植体,可以有效地隔绝空气的污染,保持钛表面高生物活性,更有利于早期骨结合的形成。4.常规经过表面处理的钛种植体暴露在空气中短时间就会被污染,其原因主要是碳氢化合物的增加,可能还会有其它一些影响因素还需要进一步探讨。