【背景】结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在我国,发病率呈逐年上升趋势,目前居恶性肿瘤发病率第四位,预计在我国结直肠癌发病率上升的趋势还将进一步发展。流行病学调查发现,维生素D在预防和减少结肠癌的发病率和死亡率中发挥重要的作用。作为一种潜在的抗肿瘤药物,维生素D3具有广阔的临床应用前景。因此,深刻理解维生素D3的抗肿瘤作用机制对临床的有效应用尤为重要。研究表明,通过下调TGF-β信号通路而抑制细胞生长和诱导凋亡是维生素D3抗肿瘤增殖的重要作用机制。而Runx3蛋白是TGF-β信号转导通路下游的关键因子,Runx3蛋白的失活使得TGF-β信号通路发生紊乱,从而导致肿瘤的发生。其中,Runx3是Runt结构域转录因子（Runx1、Runx2和Runx3）家族成员之一,是一种新型的抑癌基因;在胃癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等中都发现有不同程度的转录失活或表达下调。研究表明,结肠癌组织中Runx3表达明显低于正常组织,恢复结肠癌细胞中Runx3的活性,可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。鉴于共同的信号转导通路,维生素D3的抗肿瘤作用机制是否与Runx3的表达有关尚无研究报道。而且,已有研究证实,维生素D3对Runt家族所有转录因子都有调控作用,可以激活髓细胞中Runx1和HL-60白血病细胞中Runx3的表达,抑制成骨细胞中Runx2的表达。那么,在结肠癌细胞中维生素D3是否对Runx3的表达有诱导作用?因此,本课题将对维生素D3对结肠癌细胞中Runx3的表达影响及其机制进行探讨。【目的】1、明确维生素D3的抗结肠癌细胞增殖作用与上调Runx3的表达是否相关;2、探讨维生素D3上调Runx3表达的可能机制。【方法】1、利用western blot检测结肠癌细胞系中Runx3的表达;2、利用RT-PCR和western blot分别检测不同浓度的维生素D3作用及相同浓度的维生素D3作用不同时间段后结肠癌细胞中Runx3 mRNA和蛋白表达水平的变化;3、基因重组的方法构建含有Runx3特异性siRNA的表达载体;4、siRNA转染结肠癌细胞SW480,经G418筛选获得稳定低表达的细胞系;5、MTT法和流式细胞术检测维生素D3对转染前后的细胞生长作用的影响;6、Western blot检测cyclin A, cyclin D1, cyclin E, cdk2, cdk4, PCNA ,Rb and p27蛋白水平的表达变化。【结果】1、结肠癌细胞中Runx3的表达情况对结肠癌细胞系Runx3的表达进行western blot检测结果显示:Lovo细胞Runx3表达缺失;HT-29、SW620细胞系中Runx3有微弱表达。SW480细胞系Runx3表达水平相对较高。2、维生素D3诱导SW480细胞Runx3基因表达的时间和剂量依赖性增加利用RT-PCR技术检测经不同浓度维生素D3作用后SW480结肠癌细胞中Runx3基因mRNA表达水平的变化,发现未经药物处理的细胞中Runx3基因低表达,分别用10^-10、10^-9、10^-8、10^-7 mol/L的维生素D3作用后,细胞中Runx3 mRNA的表达量逐渐增加,具有明显的剂量依赖性。Western blot结果显示细胞中Runx3在蛋白表达水平也呈剂量依赖性增加,与RT-PCR结果一致。其中,维生素D3的作用浓度为10-8mol/L时,Runx3的表达已明显增加,我们以此浓度进行后续实验。10^-8mol/L的维生素D3作用于SW480结肠癌细胞,western blot检测作用不同时间后（6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）Runx3蛋白表达水平。结果显示,随着维生素D3作用时间的推移,Runx3蛋白的表达量逐渐增加,其中在72h达高峰。3、维生素D3通过诱导Runx3表达抑制结肠癌细胞的增殖成功构建了含有Runx3特异性siRNA的表达质粒Runx3-si。选取结肠癌细胞SW480（表达中等强度Runx3）进行转染。经G418抗性筛选,获得稳定转染的结肠癌细胞系:SW480-siRNA和SW480-vector。RT-PCR和western blot检测验证,Runx3-si转染细胞后能显著抑制Runx3的表达。转染空载体对Runx3的表达无影响,进而获得稳定转染的敲除Runx3的结肠癌细胞系。细胞生长曲线结果显示,维生素D3作用后,SW480-siRNA细胞的生长速度显著快于对照组SW480-vector和SW480细胞,差异有统计学意义（p﹤0.05）,而对对照组SW480-vector和SW480细胞的生长抑制作用无统计学差异。Runx3基因敲除后,维生素D3的抑制作用不明显,SW480-siRNA加药前后生长速度无明显差异。流式细胞术分析结果显示,抑制Runx3基因表达后,维生素D3的抑制增殖作用减弱,细胞生长数明显增多、速度加快,G1期比例显著减少（p﹤0.05）。4、Runx3可以通过调节cyclin A, cyclin D1, cyclin E, cdk2, cdk4, PCNA ,Rb和p27等周期相关分子的表达影响细胞周期进展western blot结果显示,Runx3特异性siRNA能上调结肠癌细胞中cyclin A, cyclin D1,cyclin E,cdk2,cdk4和PCNA蛋白的表达,而下调Rb和p27蛋白的表达。维生素D3对细胞周期蛋白的影响为:抑制cyclin A,cyclin D1,cyclin E, cdk2, cdk4和PCNA的表达,而刺激Rb和p27蛋白的表达。然而,维生素D3对Runx3基因敲除细胞中的细胞相关分子的表达影响较小。【结论】本研究揭示了维生素D3通过诱导抑癌基因Runx3的表达上调而抑制结肠癌细胞增殖的证据,同时,我们发现Runx3特异性siRNA能上调cyclin A, cyclin D1,cyclin E,cdk2,cdk4, p-Rb和PCNA蛋白的表达,而下调Rb和p27蛋白的表达,从而影响细胞周期进展;与之相反,维生素D3通过抑制细胞周期进展来发挥作用;而维生素D3对Runx3基因敲除细胞中细胞周期相关分子的表达影响较小。