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牙周炎是一类由细菌感染所引起的慢性炎性疾病。其病理改变包括局部上皮细胞增殖和迁移,Sharpey’s纤维降解,以及最终所导致的牙槽骨吸收。主要组织学改变为牙周组织细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)主要结构蛋白——胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和蛋白多糖等被降解。参与对ECM的降解的因素众多,如细菌和宿主细胞所产生的蛋白酶、细胞因子等。而大量的研究表明,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在ECM降解过程中发挥了极为重要的作用。MMPs是一组Zn2+依赖的肽酶,与ECM的降解和破坏密切相关。体内外研究均表明MMPs在牙周炎的发生和发展过程中发挥重要作用。MMPs在体内的表达和活性受到复杂的调控网络调节,刺激MMPs表达的因素包括细菌及其毒力因子、细胞因子和生长因子等,但具体的调节机制未明。学者在对肿瘤的研究中发现,细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)是MMPs强力调控因子。EMMPRIN由Ellis等于1989年首先从人类肺癌细胞系LX-1中提纯,最初被称为肿瘤细胞源性胶原酶刺激因子(tumor cell-derived collagenase stimulatory factor, TCSF),其显著特征是能诱导肿瘤间质成纤维细胞MMPs的合成。但后来研究发现EMMPRIN同样存在于人类的正常组织中,且能显著诱导MMPs的产生,所以Biswas等于1995年将它重新命名为EMMPRIN.在人的外周血细胞、内皮细胞、培养的血细胞和非血源性组织中均存在EMMPRIN的表达。目前,EMMPRIN的功能尚未被完全研究清楚,但可以肯定的是它直接作为信号传导粘附分子或者作为细胞之间粘附的调节因子参与信号传导,刺激邻近细胞的MMPs表达上调,从而在胚胎发育、组织改建、创伤修复、恶性肿瘤的浸润和转移、风湿性关节炎、心血管疾病和糖尿病的发生和发展中发挥重要作用。牙周炎与恶性肿瘤的浸润和转移、以及类风湿性关节炎等存在着相似的病理过程——MMPs降解胞外基质,因此我们推测牙周组织中很可能也存在EMMPRIN的表达；且在牙周炎发生和发展过程中,EMMPRIN通过上调MMPs的表达参与对牙周组织破坏。Emingil等从健康人龈沟液中检测到可溶性EMMPRIN的表达；在牙周炎患者的龈沟液中,EMMPRIN的水平上调,且与炎症程度密切相关。但到目前为止,还没有关于EMMPRIN在牙周组织中的表达情况以及其表达水平与牙周炎的关系的相关报道。本项研究将首先通过体内外实验探寻EMMPRIN是否在存在于牙周组织中,且在牙周生理和/或病理状态下发挥作用；并通过体外实验研究EMMPRIN在牙周炎病理过程中可能发挥的作用。第一部分牙周组织中EMMPRIN的表达及其可能发挥的作用本部分包括两个实验,其中实验一的结果为实验二提供了依据,二者共同证实了牙周组织中存在EMMPRIN的表达,且与炎症程度存在一定的相关性。具体摘要如下：目的：研究EMMPRIN在牙周组织中的表达情况,分析其可能发挥的作用。材料和方法：首先收集临床健康和炎性人牙龈组织,用免疫组化和western blot检测牙龈组织中EMMPRIN蛋白表达情况；然后培养来源于不同个体,不同牙周状态的人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells, HGEC),用牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharides, Pg LPS)作用于HGEC,检测作用前后EMMPRIN、MMP-1、MMP-2和MMP-3 mRNA的表达情况。结果：免疫组化的结果显示EMMPRIN在正常牙龈角化上皮全层弱到中等强度阳性表达,基底层增强。炎性牙龈中,EMMPRIN广泛表达于上皮和上皮下结缔组织中,表达强度显著高于正常者(P<0.05),而且随着炎症程度增加,表达呈增强趋势。用western blot可从临床健康和炎性牙龈组织中检测到EMMPRIN蛋白的表达,EMMPRIN在炎性牙龈组织中的蛋白表达水平显著高于正常牙龈(P<0.05)。在未经Pg LPS处理的对照组可检测到EMMPRIN、MMP-1、MMP-2和MMP-3 mRNA的表达。与对照组相比,PgLPS处理后的HGEC中EMMPRIN和MMPs mRNA的表达存在个体差异：来源于临床健康个体、牙龈炎和轻度牙周炎患者的HGEC在作用前后EMMPRIN和MMPs mRNA的表达无显著差异(P>0.05),而来源于重度牙周炎患者的HGEC在Pg LPS刺激后mRNA的水平显著上调(P<0.05)。结论：临床健康的牙龈组织和体外培养的HGEC中均可检测到EMMPRIN的表达,提示EMMPRIN可能参与牙周组织正常的生理改建；在炎症状态下,EMMPRIN的表达水平显著增高,表达水平随牙龈炎症加重而呈增高趋势,提示EMMPRIN可能作为MMPs的诱导因子参与了对牙周组织的破坏,且与牙周炎的严重程度存在一定相关性；体外实验结果初步提示EMMPRIN可能与重度牙周炎相关,在受到致病因素作用后,上皮中的EMMPRIN表达一旦上调,即可启动MMPs的过量合成,导致牙周组织的严重破坏。第二部分EMMPRIN在牙周炎病理过程中的作用机制研究目的：体外建立牙龈上皮细胞-成纤维细胞间接“交谈”模型,研究EMMPRIN是否在牙周炎病理过程中参与对MMPs表达的调控；体外培养人牙周成纤维细胞(牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞),探讨EMMPRIN是否作为一种信号分子介导细胞因子对牙周成纤维细胞MMPs的调控。材料和方法：建立角化细胞系HaCat与牙龈成纤维细胞共培养模型,通过抗EMMPRIN抗体阻断EMMPRIN的信号传导,检测下室成纤维细胞EMMPRIN、MMP-1、MMP-2和MMP-3蛋白与mRNA的表达,分析干扰前后的表达差异；体外培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,分别用IL-1p或TNF-α刺激后,检钡EMMPRIN、MMP-1、MMP-2和MMP-3蛋白(?)mRNA的表达,分析EMMPRIN与MMPs的相关性。结果：在未处理的对照组牙龈成纤维细胞中,可从蛋白和mRNA水平检测到EMMPRIN以及MMP-1、MMP-2和MMP-3的表达。HaCat和牙龈成纤维细胞共培养后,下室中MMPs的表达发生显著改变,特别是HaCat在经Pg LPS作用之后再和成纤维细胞共培养,MMPs的上调更为显著。在共培养体系中加入EMMPRIN抗体后,下室MMPs的表达水平显著降低；IL-1β和TNF-a均可上调牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞MMP-1、MMP-3蛋白和mRNA的表达水平,这两种细胞因子也可上调牙周膜细胞MMP-2的表达,但对牙龈成纤维细胞MMP-2的水平无显著影响。但成纤维细胞EMMPRIN蛋白和mRNA的表达水平并不随着MMPs的改变而改变。结论：EMMPRIN可表达于正常的牙周成纤维细胞,并可能通过调节MMPs的表达而在牙周组织改建过程中发挥一定作用；EMMPRIN和细胞因子均可参与对牙周成纤维细胞MMPs的调节,但二者的信号通路可能彼此独立。