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原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是世界上常见的恶性肿瘤之一,广西是原发性肝细胞癌高发区。多年来动物实验及人类流行病学研究表明:长期慢性暴露于黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)与肝癌发生有明显的关系。其主要原因可能是AFB1经体内代谢活化后产生终产物,导致细胞遗传特性改变,进而发挥其致癌致突变效应。然而目前人体对AFB1暴露、代谢、解毒及DNA修复过程中的复杂分子机制仍有诸多不明之处,缺乏可用于AFB1相关性肝癌早期诊断的稳定、便捷、准确的分子标志物及治疗药物作用靶点,因此探讨疾病发生发展过程中的生物标记物是非常重要的。随着后基因组时代的到来,人们逐渐认识到:复杂的基因间和蛋白质间的相互作用,细胞内活动和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译加工。AFB1主要通过其终致癌物和DNA结合形成加成物而对靶基因造成损害。基因的产物是蛋白质,细胞表型改变最终通过蛋白质体现,蛋白质是生命功能的主要执行者。目前蛋白质组的研究方法已成为肿瘤学研究的有力工具,表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是近些年来新兴的一种蛋白质组学研究方法,具有高通量性及高灵敏度,现已用于多种疾病早期生物标记物的检测和诊断的研究。本课题针对广西AFB1暴露的背景,以广西地区肝癌癌旁肝组织为研究对象,采用免疫组化法检测组织中AFB1-DNA加合物。以组织AFB1-DNA加合物作为AFB1暴露的分子标志物,根据其水平的高低分为高AFB1暴露组和低AFB1暴露组,再以正常肝组织作为对照,采用SELDI-TOF-MS技术分析比较高AFB1暴露组癌旁肝组织、低AFB1暴露组癌旁肝组织、正常肝组织蛋白质指纹图谱,筛选出与AFB1致肝癌形成过程中相关的差异表达蛋白。有利于阐明特定环境致癌因素AFB1的致病机理以及对AFB1相关性肝癌癌前预防、早期诊断指标的筛查,为在AFB1暴露地区HCC的预防和早期诊疗的研究提供重要的理论依据。第一部分免疫组织化学法检测肝癌癌旁肝组织中AFB1-DNA加合物目的:根据肝癌患者癌旁肝组织中AFB1-DNA加合物水平,为第二部分AFB1不同暴露的研究提供实验依据。方法:参照Regina M. Santella等免疫组织化学法,检测36例来自广西地区肝癌患者的癌旁肝组织石蜡切片中AFB1-DNA加合物。在高倍镜下观察肝组织细胞胞核、胞膜或胞浆内呈紫黑色的阳性颗粒,根据染色程度和阳性颗粒细胞百分率累积得分判定AFB1-DNA加合物的水平。在进行每批肝组织AFB1-DNA加合物免疫组化染色时,同时采用阳性和阴性对照。结果:在肝癌癌旁肝组织中不同程度地检测到AFB1的存在,其主要集中在肝细胞核内,与核内的DNA形成加合物,呈紫黑色颗粒染色。肝细胞膜、细胞浆内也有少量的存在,但不出现在肝胆管上皮细胞核内。染色阳性颗粒细胞在高倍镜下分布为5～90%,多以弥漫状分布为主。经统计,23例癌旁肝组织AFB1-DNA加合物呈高水平(积分3～6),另外13例呈低水平(积分0～2)。结论:AFB1- DNA加合物水平有助于评估肝癌患者AFB1暴露情况,为AFB1不同暴露的研究提供实验依据。第二部分SELDI蛋白芯片技术筛选AFB1相关性肝癌肝组织的差异蛋白目的:筛选出广西地区AFB1相关性肝癌癌旁肝组织的差异表达蛋白,以期发现与AFB1致肝癌形成过程中的相关性蛋白质。方法:以组织AFB1-DNA加合物作为AFB1暴露的分子标志物,根据第一部分检测AFB1-DNA加合物水平的高低将肝癌癌旁肝组织分成高AFB1暴露组(AFB1-DNA加合物高水平,23例)和低AFB1暴露组(AFB1- DNA加合物低水平,13例),并选择14例正常肝组织作为对照。采用CM10蛋白芯片,利用SELDI-TOF-MS技术对各组织提取蛋白样本进行检测,得到三组肝组织蛋白质指纹图谱。并采用Biomarker Wizard软件进行统计学分析,筛选出各组间表达差异蛋白。结果:1.肝癌患者癌旁肝组织与正常肝组织蛋白质质谱图比较,共检测到130个蛋白峰,其中m/z为4580.40、7282.32、17890.55、38727.02等9个稳定的蛋白峰差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,肝癌患者有5个表达上调,另外4个表达下调。2.高AFB1暴露组肝癌患者癌旁肝组织与正常肝组织对照组蛋白质质谱图比较,共检测到132个蛋白峰,其中10个蛋白峰差异有统计学意义(P< 0.05)。与正常对照组相比,高AFB1暴露组有5个表达上调,5个下调。3.低AFB1暴露组肝癌患者癌旁肝组织与正常肝组织蛋白质质谱图比较,共检测到132个蛋白峰,其中13个蛋白峰差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,低AFB1暴露组有6个表达上调,另外7个表达下调。4.高AFB1暴露组与低AFB1暴露组肝癌患者癌旁肝组织蛋白质质谱图比较,共检测到132个蛋白峰,其中7个蛋白峰差异有统计学意义(P<0.05)。与低暴露组相比,高AFB1暴露组有3个表达上调,4个表达下调。5.通过比较三组组织标本蛋白质的变化,发现质荷比为1126.90的蛋白表达水平呈高AFB1暴露组>低AFB1暴露组>正常对照组(P<0.05);质荷比为10134.59、10881.76的蛋白在高AFB1暴露组和正常对照组的表达均高于低暴露组(P<0.05);质荷比为3734.96、8096.21的蛋白在高AFB1暴露组的表达低于低AFB1暴露组和正常对照组(P<0.05),提示该类蛋白可能参与了AFB1相关性肝癌组织病变的异常功能代谢。结论:SELDI蛋白芯片技术结合生物信息学技术筛选出AFB1相关性肝癌癌旁肝组织的表达差异蛋白,为广西AFB1相关性肝癌癌前预防、早期诊断指标的筛查提供理论依据。