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第一部分 急性斑蝥素中毒大鼠毒理病理学实验研究目的:构建急性斑蝥素染毒大鼠动物模型,完善斑蝥素急性中毒毒理病理学内容。方法:将清洁级SD大鼠经灌胃途径给予斑蝥素染毒,根据染毒剂量（1 mg/kg,1.3mg/kg,1.69 mg/kg,2.19 mg/kg,2.82 mg/kg,3.67 mg/kg,4.73 mg/kg,6.15 mg/kg,8 mg/kg）进行分组,以此构建阶梯浓度染毒大鼠动物模型并观察分析大鼠斑蝥素染毒前后毒理行为学、死亡时间、半数致死量、组织病理学变化等内容。结果:本次实验成功建立了经灌胃途径急性斑蝥素染毒大鼠模型,毒理行为学观察分析发现:急性斑蝥素染毒大鼠出现活动减少、皮肤湿冷、呼吸异常、内脏痛、阴茎勃起/阴道流血、血尿、神经功能缺损等多系统中毒表现;且内脏痛评分、神经功能缺损评分与染毒剂量呈正相关。半数致死量区间计算分析得出:采用孙氏改良寇氏法和BLISS法计算得到的大鼠急性斑蝥素中毒半数致死量分别为2.68mg/kg和2.67 mg/kg。组织病理学观察分析发现:急性斑蝥素中毒大鼠各主要器官组织病理改变以缺血缺氧、炎症、出血等为主;其中组织病理学评分结果发现心脏组织病理学评分较其他器官显著升高。结论:成功构建了急性斑蝥素中毒大鼠动物模型,斑蝥素染毒后大鼠可出现活动减少、体温改变、内脏痛、神经功能缺损等多系统中毒表现;组织病理学改变以缺血缺氧、炎症、出血等为主且主要靶器官损害为心脏。经BLISS法测得的大鼠经灌胃途径斑蝥素染毒LD50（2.67 mg/kg）可作为后续实验染毒剂量的参考。第二部分 急性斑蝥素中毒大鼠心肌损伤分子生物学实验研究目的:观察不同剂量斑蝥素染毒大鼠心肌组织中缺血缺氧相关蛋白VEGF、HIF-1α及凋亡相关蛋白caspase9表达,寻找用于评估中毒后心肌损伤严重程度的分子生物标志物。探索斑蝥素染毒后及中毒死亡后大鼠血清TN-T、VEGF、HIF-1α表达变化作为斑蝥素中毒心肌损伤早期预测及死后诊断指标的可行性。探讨不同剂量斑蝥素染毒大鼠心肌差异mRNA、miRNA表达变化,以初步发掘斑蝥素中毒心肌损伤可能的分子生物学机制。方法:在第一部分研究中所得LD50剂量水平的基础上,选用雄性清洁级SD大鼠25只,体重200-250 g,随机分为对照组、0.5 LD50组、LD50组、1.5 LD50组、2 LD50组,经灌胃途径建立不同剂量斑蝥素染毒大鼠动物模型,每组5只,染毒6 h后采用生理盐水进行心脏灌流后取心脏备用,采用三色免疫荧光、Western blot方法检测心肌组织中缺血缺氧相关蛋白VEGF、HIF-1α及凋亡相关蛋白caspase9表达。按照第一部分研究中所得LD50剂量水平,选用雄性清洁级SD大鼠40只,体重200-250 g,经灌胃途径建立不同染毒时长的斑蝥素中毒大鼠模型,根据染毒时长分为染毒前、染毒后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h共10组,每组4只;按照1.5 LD50剂量水平,选用雄性清洁级SD大鼠54只,体重200-250g,经灌胃途径建立斑蝥素中毒死亡大鼠模型,中毒死亡大鼠随机分为死后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、168 h共6组,每组5只。上述所有大鼠在染毒后/死后各规定时间段经开胸穿刺后留取心血,采用ELISA方法检测大鼠血清TN-T、VEGF、HIF-1α表达。选用雄性清洁级SD大鼠13只,体重200-250 g,随机分为对照组（n=3）、低剂量斑蝥素(0.5 LD50)染毒组（n=5）、高剂量斑蝥素(LD50)染毒组（n=5）;所有大鼠均经灌胃途径染毒24 h后给予生理盐水心脏灌流后取心脏于液氮中迅速冻存后置于-80℃保存;提取心肌RNA后采用Illumina技术进行转录组测序,DEGseq方法进行差异mRNA检测,MA-plot方法筛选各组差异表达mRNA,并采用GO分析、KEGG Pathway、GSEA等生物信息学分析方法对其相关功能进行分析。基于转录组测序分析结果,进一步通过mRNA-miRNA网络预测急性斑蝥素中毒大鼠心肌差异表达miRNA,综合文献检索、miRNA功能及结构稳定性预测分析结果筛选拟验证miRNA。最后采用RT-q PCR方法检测筛选所得与循环系统关系密切的差异表达mRNA、miRNA,验证其用于评估急性斑蝥素中毒心肌损伤的可行性。结果:不同剂量斑蝥素染毒大鼠心肌缺血缺氧相关蛋白表达统计分析结果显示,急性斑蝥素中毒大鼠心肌细胞内出现VEGF、HIF-1α、caspase9共表达且三者表达升高与染毒剂量呈一定正相关。斑蝥素染毒后各时间段大鼠血清TN-T、VEGF、HIF-1α总体表达较染毒前显著升高;时间变化趋势显示血清TN-T和VEGF表达分别在染毒后1 h和2 h达到峰值,血清HIF-1α表达改变未见明显峰谷变化;相关性分析结果发现血清VEGF表达与血清TN-T表达之间呈正相关。斑蝥素中毒死亡大鼠死后血清TN-T表达、HIF-1α/TN-T比值与对照组比较结果具有统计学差异,且ROC曲线显示血清TN-T、HIF-1α/TN-T比值在斑蝥素中毒心肌损伤死后诊断中具有一定准确性和较好的特异度及灵敏度;死亡时间相关分析结果显示,斑蝥素中毒死亡大鼠血清VEGF/HIF-1α比值与死亡时间呈线性相关。高通量转录组测序共得到171个三组间共差异表达mRNA;GO富集分析结果发现相关生物学功能主要富集到细胞外基质功能;KEGG Pathway富集分析结果显示,与对照组相比,高、低剂量组分别显著富集到18和9个通路,高、低剂量组间比较后显著富集到5个通路;GSEA分析结果显示,与对照组相比,高、低剂量组富集得到的基因集较多,富集得到Focal adhesion、ECM受体相互作用、Protein digestion and absorption pathway等差异表达基因集。在三组间共差异表达mRNA功能分析的基础上,初步筛选得到与循环系统关系密切的5个mRNA（Myh7、Tnc、Ldlr、11β-HSD2、Scd）并进行RT-q PCR验证,验证结果发现斑蝥素染毒后大鼠心肌Myh7、11β-HSD2基因表达水平显著升高,而Tnc、Ldlr、Scd基因表达水平均显著降低。基于mRNA-miRNA网络对171个心肌共差异表达mRNA进行靶向关联转换预测分析后共得到1386个miRNA,其中与Myh7、Tnc、Ldlr、11β-HSD2、Scd相关的miRNA有216个。综合文献检索、miRNA功能及结构稳定性预测分析等结果,初步筛选得到mi R-133a-3p、mi R-150-3p、mi R-214-3p、mi R-146a-5p共4个miRNA并进行RT-q PCR验证,验证结果发现斑蝥素染毒大鼠心肌mi R-146a-5p表达显著降低,高剂量染毒组大鼠心肌mi R-133a-3p表达显著升高,斑蝥素染毒大鼠心肌mi R-150-3p和mi R-214-3p表达呈降低趋势但无统计学差异。结论:急性斑蝥素染毒大鼠心肌细胞内出现VEGF、HIF-1α、caspase9共表达,且三者表达量随染毒剂量的增加呈升高趋势;血清TN-T、VEGF可作为急性斑蝥素中毒心肌损伤早期预测的分子生物标志物;血清TN-T、HIF-1α/TN-T比值可作为斑蝥素中毒大鼠心肌损伤死后诊断的分子生物标志物;血清VEGF/HIF-1α比值具有作为斑蝥素中毒死后死亡时间推断分子生物标志物的潜在价值。急性斑蝥素染毒可引起心肌mRNA、miRNA表达改变,二者间相互调控可能参与斑蝥素中毒心肌损伤的病理生理过程;Myh7、Tnc、Ldlr、11β-HSD2、Scd、mi R-133a-3p、mi R-146a-5p表达可作为预测及评估急性斑蝥素中毒心肌损伤的分子生物标志物。综上,本研究中针对斑蝥素染毒大鼠毒理行为学以及各器官组织病理改变的实验研究丰富完善了斑蝥素中毒毒理病理学内容。基于缺血缺氧相关蛋白、mRNA及miRNA三个层面开展的急性斑蝥素中毒心肌损伤分子生物学实验研究,得到部分可用于斑蝥素中毒心肌损伤的临床及死后诊断的分子生物标志物,同时也为进一步研究斑蝥素中毒心肌损伤的分子毒理学机制提供了基础。