戊型肝炎病毒(HEV)为单链RNA病毒，无包膜，主要通过胃肠道传播，引起急性戊型肝炎。戊型肝炎呈全球性分布，但主要累及发展中国家，是一种普遍流行、危害严重的疾病。HEV的广泛存在，已经成为一项关系公众健康和社会稳定的严重公共卫生问题。因此，开发与研制戊型肝炎疫苗对阻止HEV的传播及提高人口质量和卫生保健水平有着深远的意义。 由于HEV细胞培养尚不成功，目前主要研究HEV重组疫苗，ORF2及其编码蛋白是目前研究最多的戊型肝炎候选疫苗成分。由于HEV是一种经胃肠道途径传播的病毒，因此通过口服等免疫诱导胃肠道局部粘膜免疫对抵抗HEV感染会有重要作用。本研究以减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体，采用来自南京地区戊型肝炎散发病例的第Ⅳ基因型毒株，选用其编码ORF2蛋白中含HEV中和抗原表位的439-617位氨基酸(p179)片段的基因序列，将其与PYA3341质粒重组并转化减毒鼠沙门氏菌χ4550，建立了能稳定表达p179蛋白的戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门氏菌候选疫苗株。我们将此疫苗株通过口服和鼻饲两种不同途径免疫小鼠，观察其免疫效果。本实验分为三个部分： 1南京地区戊型肝炎病毒基因型的鉴定及毒株的选择 利用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nPCR)的方法检测南京地区40份急性散发性戊型肝炎患者的粪便标本，将所获得的PCR阳性产物进行测序。采用分子生物学软件LASERGENE和PHYLIP软件包进行序列的同源性比较、遗传距离计算以及基因进化树的绘制，利用生物信息学软件比较核苷酸的同源性、遗传距离，进行基因分型。40份粪便标本中检测到14份阳性HEVRNA，检出率为35％，基因分型均为Ⅳ型HEV，说明南京地区散发性戊型肝炎均由Ⅳ型HEV引起，提示目前国内散发性戊型肝炎的病原主要为Ⅳ型HEV。因此我们选择Ⅳ型HEV毒株ORF2蛋白中439-617位氨基酸(p179)片段进行构建戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门氏菌候选疫苗。 2戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门氏菌候选疫苗株的构建与鉴定 应用DNA重组技术构建了表达HEVORF2蛋白-p179的减毒鼠伤寒沙门氏菌候选疫苗。用RT-PCR方法扩增HEVORF2编码HEV中和抗原表位的基因片段，将其插入表达载体PYA3341中，构建重组质粒PYA3341-179，再将该重组质粒转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株χ550，获得重组菌株χ4550(PYA3341-179)。应用免疫印迹对重组菌所表达的重组蛋白进行免疫分析，其结果显示该重组菌可表达重组ORF2蛋白，并且可以与病人血清和不同基因型HEV单克隆抗体发生免疫反应；该无抗药性的杂合菌株在体外营养选择压力下可较稳定携带重组质粒传代繁殖。用免疫剂量的重细细菌免疫BALB/c小鼠后，观察一个月未见有异常现象，同时发现该菌株在体内也可较稳定携带重组质粒传代繁殖。表明戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门氏菌重组菌株χ4550(PYA3341-179)可用于戊型肝炎疫苗的研究。 3戊型肝炎重组候选疫苗株χ4550(PYA3341-179)的体液免疫学特性 将减毒鼠伤寒沙门氏菌χ4550和所构建的重组菌株χ4550(PYA3341-179)以4×1011菌落形成单位(CFU)/只剂量，用口服和鼻饲两种不同途径免疫雌性BALB/c小鼠，分成4组，每组6只。分别采集免疫前以及免疫后的小鼠血清、粪便标本。用来自7种基因型和亚型HEVORF2C端p166多肽的重组蛋白混合物(p166Mix)和内毒素(LPS)作为抗原，检测各组血清、粪便标本中特异性的IgG和IgA。结果表明，在血清标本中，存在抗p179蛋白和LPS特异性的IgG；而在小鼠粪便标本中测出抗上述两种抗原的特异性IgA。结果表明我们所构建的戊型肝炎减毒伤寒沙门氏菌重组菌株χ4550(PYA3341-179)免疫小鼠后，能够诱导HEV特异性的IgG和IgA。 综上所述，我们通过对南京地区HEV的基因型的鉴定，选取了HEVⅣ型毒株ORF2蛋白中439-617位氨基酸(p179)片段进行构建戊型肝炎减毒鼠伤寒沙门氏菌候选疫苗株;所构建的重细疫苗株χ4550(PYA3341-179)在体外能够与不同病人血清和不同基因型HEV单克隆抗体发生免疫反应，在体内能够刺激小鼠产生特异性抗体，可以作为戊型肝炎候选疫苗，具有良好应用前景。