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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是黑质纹状体多巴胺能神经元损害为主的神经变性病,其病因目前尚不清楚,可能是涉及了环境和遗传等多因素的影响。线粒体呼吸链抑制剂MPP+和其化学结构类似物百草枯均可以引起多巴胺能神经元的损害。大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株具有多巴胺能神经元的特点,因此,被用于MPP+和百草枯的毒性研究。保护多巴胺能神经元是PD治疗中的一大难题。单胺氧化酶B的抑制剂L-Deprenyl在体外实验中显示出具有良好的神经保护作用。一些神经营养因子也可以保护变性疾病中的易损神经元,维持其正常功能的发挥。在动物实验中已证实碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)具有保护多巴胺能神经元的作用,其对神经元的保护作用是可以通过诱导活化素βA(activin βA , Act βA)的表达来实现的。胶质源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是目前认为最有效的可保护黑质纹状体系统多巴胺能神经元的营养因子,其神经营养作用程度与活化素A(activin A, Act A)是相同的。Act A是转化生长因子β(Transforming growth factor beta ,TGF-β)超家族的成员之一,由βA-βA两个β亚单位组成。活化素家族还包括活化素B(activin B, Act B)和活化素AB(activin AB, Act AB),分别由βB-βB及βA-βB两个β亚单位组成。近年研究发现,在缺血、创伤、兴奋性毒性物质损害后,海马和齿状回处的Act βA mRNA的表达水平上调,Act βB mRNA表达未发生变化,活化素受体IIA(activin receptor IIA, Act RIIA)的mRNA表达水平下调。外源性应用Act A可以保护这些部位的神经元,提示Act A可能是一种神经保护因子。但是,百草枯和MPP+损害后,多巴胺能神经元上Act的不同亚单位和其受体如何变化,目前没有相关报道;外源性应用Act A是否可以保护多巴胺能神经元免受百草枯和MPP+损害的研究鲜见报道;Act A保护作用的机制如何,目前无相关报道。因此,探讨Act A在多巴胺能神经元保护方面的作用,对PD发病机制的认识及寻找新的治疗途径具有重要的意义。本研究首先利用了逆转录-多聚酶链反应(reverse transcriptase –polymerase chain reaction, RT-PCR)方法来观察百草枯和MPP+损害后,PC12细胞的Act βA mRNA、Act βB mRNA、Act RIIA mRNA及抑制素(inhibin) α mRNA表达的时程变化,并用台盼蓝染色法观察损害后细胞活力的变化。 <WP=7>然后预先24h给予PC12细胞重组人活化素A(recombinant human activin A, rhAct A)和L-Deprenyl,利用MTT法观察损害后细胞活力的变化;免疫细胞化学法测定细胞的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH) 蛋白和Bcl-2蛋白水平的变化;RT-PCR法测定TH mRNA和Bcl-2 mRNA表达水平的变化;脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)来评价细胞凋亡的变化。通过比较Act A组、L-Deprenyl组与损害组之间的差异,探讨Act A对百草枯和MPP+损害的保护作用及其可能的作用机制。结果1、百草枯组和MPP+组在损害后3h、6h、12h和24h时,PC12细胞Act βA mRNA、Act βB mRNA和Act RIIA mRNA的表达水平随损害时间的延长呈现逐渐下降的趋势,在损害后3h开始降低,于损害后24h降至最低。相比之下,对照组的Act βA mRNA、Act βB mRNA和Act RIIA mRNA的表达水平在上述各时间点无明显变化。inhibin α mRNA在上述的各个不同时间点与对照组相比,无明显变化。百草枯组和MPP+组在损害后的3h和6h,PC12细胞活力无明显改变;损害后12h和24h,细胞活力出现明显的降低,与对照组相比有显著差异。2、百草枯组和MPP+组在损害后12h和24h,PC12细胞的TH mRNA和Bcl-2 mRNA的表达、TH蛋白和Bcl-2蛋白水平均下调,并且细胞活力下降,凋亡细胞明显增多。Act A组和L-Deprenyl组在损害后12h和24h时,PC12细胞的TH mRNA和Bcl-2 mRNA表达、TH蛋白和Bcl-2蛋白水平增加;细胞活力增加,凋亡细胞明显减少。两组分别与百草枯组和MPP+组相比,有显著差异。但比较活化素A组和L-Deprenyl组的保护作用,两组间无明显差异。结论:1、百草枯和MPP+的损害,可以下调PC12细胞Act βA mRNA、Act βB mRNA和Act RIIA mRNA的表达水平,降低细胞活力。所以,PC12细胞的损害可能与Act及其受体的表达水平下调有关。2、外源性应用rhAct A可以提高PC12细胞活力,减少凋亡,其作用机制可能是通过预防百草枯和MPP+损害后Bcl-2表达水平的下调来实现的。