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目的在本实验中,我们通过分离、纯化、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),建立稳定的大鼠BMSCs体外培养体系,研究阿托伐他汀钙对成骨分化表达的影响;并且通过建立大鼠骨质流失尾部悬吊模型(Tail-suspended,TS),探究不同剂量的阿托伐他汀钙对治疗骨质流失模型大鼠预后的影响,旨在为骨质疏松症的治疗提供新思路。方法1.体外实验:(1)BMSCs的提取:取4周龄的SD雄性大鼠,用安乐死的方法处死后,严格无菌操作下,剥离获取大鼠后肢长骨,然后使用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和含双抗的DMEM冲洗大鼠骨髓腔,采用密度梯度离心全骨髓贴壁法分离、纯化、培养出原代骨髓细胞(为混合细胞),将混合细胞种植在培养皿中待细胞聚集贴壁,镜下观察到贴壁细胞呈纤维样聚落式生长,继续培养3天后第一次换培养液并用Giemsa染色细胞在显微镜下观察细胞形状特征;培养到第7天镜下可见大量聚落并融合在一起的细胞群,覆盖面超过皿底的80%以上,再次用Giemsa染色细胞在显微镜下再次观察细胞形状特征;此时,行第一次传代培养,当细胞保持着稳定的生长速度与典型的形态特征时,传至第三代培养7天,再次用Giemsa染色细胞在显微镜下再次观察细胞形状特征,并以流式细胞术鉴定干细胞标记物,确保所获细胞为BMSCs时将第三代细胞用于实验。(2)不同浓度AT对BMSCs分化的影响:体外实验分为6组,包括(-)组(正常培养基)、(+)组(含成骨诱导液培养基)和加药组(含成骨诱导液培养基+AT溶液,(+)+AT组),其中加药组又包含四组不同AT浓度组,即10-5mmol/L组、10-6mmol/L组、10-7mmol/L组和10-8mmol/L组。分别用不同浓度的AT混合液(10-5mmol/L组、10-6mmol/L组、10-7mmol/L组和10-8mmol/L组)去分别诱导培养干细胞7天、14天和21天,使用茜素红染色及ALP染色检测钙结节的形成与沉淀情况,并通过PCR检测三个成骨基因(ALP、OCN和Runx2)的表达效果。2.体内实验:(1)建立骨质流失大鼠模型:选取200-220g左右的雄性SD大鼠随机分成(-)组(正常饲养组,10只),TS组(单纯尾巴悬吊组,10只),给予(-)饲养组的SD大鼠正常饲养,TS组将大鼠尾吊起使双后肢悬空,分别于第21天、28天处死,取后肢长骨制作骨切片标本并进行HE染色、TRAP染色,观察到组织切片有明显骨量减少及破骨细胞显著增多,说明建模成功。(2)不同浓度AT对骨质流失模型大鼠的影响:骨质流失模型建造成功后,将SD大鼠随机分为5组,(-)组(正常饲养组,10只),TS组(单纯尾巴悬吊组,10只),TS+AT组(尾巴悬吊+加药组,30只)。其中将TS+AT组分为三组(每组10只):TS+AT1、TS+AT2、TS+AT3分别代表1 mg/kg/d组、2 mg/kg/d组、4 mg/kg/d组。每天一次通过灌胃直接注药治疗28天,不给药治疗组((-)组和TS组),统一采用等量的生理盐水灌胃对照治疗,实验结束后给与安乐死,取股骨切片标本,分别采用HE染色、TRAP染色观察骨量及破骨细胞数量以评估AT对治疗骨质疏松的效果。结果1.体外实验:(1)BMSCs的提取与鉴定:镜下观察传代三次的大鼠BMSCs呈梭状,贴壁均匀生长,整体表现出聚集螺旋状排列,形态统一;且用流式细胞术判定出传代三次的大鼠BMSCs表面CD90、CD44标记物的阳性率分别为96.78%与99.92%,而CD34的阳性率仅为0.79%,表明所取BMSCs符合实验标准。(2)与对照组((-)组、(+)组)相比,4个加药组的钙结节数量更多(均P<0.05),且4个加药组的三个成骨基因(ALP、OCN和Runx2)表达水平更高(均<0.05);不同浓度AT组间比较,药剂浓度为10-6mmol/L组的成骨基因水平明显高于10-5mmol/L、10-7mmol/L和10-8mmol/L组(均<0.05),表明阿托伐他汀钙具有增强BMSCs向成骨分化的作用,且10-6mmol/L为最佳药物诱导浓度。2.体内实验:(1)建立骨质流失大鼠模型:与(-)组相比,TS组大鼠后肢股骨骨量显著减少、破骨细胞显著增多(均<0.05),且随着悬吊时间的延长,尾部悬吊组骨量减少越明显、破骨细胞越多,表明建模成功。(2)不同浓度AT对骨质流失模型大鼠的影响:在建模成功的基础上,接下来实验统一采用28天悬吊周期进行研究。与(-)组比较3个TS+AT组大鼠后肢股骨骨量显著减少及破骨细胞数量显著增多(均<0.05);而与TS组比较,3个TS+AT组大鼠后肢股骨骨量均显著增加及破骨细胞数量显著减少(均<0.05);而3个加药组之间比较结果显示,2 mg/kg/d组大鼠后肢股骨骨量最多且破骨细胞数量最少(均<0.05)。本实验表明AT可以显著减少骨质流失,对骨质疏松有治疗效果。结论1.适宜浓度的AT药剂,在体外诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化的效果明显,其机制与增强成骨基因(ALP/OCN/Runx2)的表达有关,且本实验筛选出的最佳药物诱导浓度为10-6mmol/L;2.适宜剂量的AT可以显著改善骨质流失模型大鼠的骨质疏松状况,且2 mg/kg/d的给药剂量表现出更明显的效果。