背景 骨关节病是骨科临床上的常见病，关节软骨往往受累。早在200年前人们已经认识到关节软骨损伤后修复能力非常有限，受损的软骨在机械磨损和酶的破坏双重作用下进一步发生退变，常常发展成为退行性关节炎，终致关节疼痛，功能丧失。多年来人们尝试了多种方法修复缺损的关节软骨，如骨膜软骨膜移植、自体骨软骨细胞移植等，都难以获得满意的疗效。现在临床上最常用的方法是人工关节置换，但应用假体存在感染、松动及需要二次翻修等问题。目前国内、外关于关节软骨损伤的治疗趋势已由置换转入修复重建的研究，即运用组织工程学的方法在体外构建组织工程化关节软骨，移植修复关节软骨缺损。 随着基因工程的发展，分子生物学与组织工程学有机结合，运用分子生物学的理论和技术，从分子水平研究细胞、组织诱导因子、生物材料及其相互作用，为研制能更有效地恢复、维持或改善病损组织功能的生物替代物奠定基础。 特别是以病毒载体为基础的基因转移技术的应用，为组织工程学中细胞因子的获得提供了一条切实可行的新思路。腺病毒载体的出现给我们带常四军医大学俘d匕论文来了很多优点:能有效转染增殖和非增殖细胞，编码蛋白表达高，没有插入性突变的危险，无包膜不易被补体灭活等。腺病毒载体被认为是基因治疗中很有前途的重要工具。组织工程和基因工程的有机结合，为彻底解决软骨缺损修复问题带来了希望。 目的以复制缺陷的腺病毒Adeno一xTM为基因转移载体，制备携带TGF一pl和BMP一7等促软骨生长细胞因子基因的高滴度腺病毒液，感染兔骨髓基质干细胞，利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达软骨细胞表型。再将软骨前体细胞与同种异体骨基质明胶支架相复合，在体外构建组织工程化软骨，移植修复兔自体膝关节软骨缺损，观察该方法的可行性和有效性，以期找到一种较好的修复关节软骨缺损的方法。 方法(l)采用逆转录PCR方法自多种组织和细胞总RNA中扩增获得转化生长因子pl基因，经测序后与Genebank中序列进行比较分析。(2)将hTGF一脚和hBMP一7基因分别亚克隆至穿梭质粒p一Shu川e上，经PI一Scel和I一Ceul双酶切后与线性化腺病毒骨架质粒Adeno一X连接，构建重组腺病毒质粒。鉴定后再经Lipofeetamine 2000转染HEK 293细胞，包装出高滴度的重组腺病毒液。(3)采用密度梯度离心法自骨髓中分离培养人骨髓基质干细胞，观察原代及传代MSCS形态特点、生长特性和特殊染色，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性。(4)用携带外源性目的基因的腺病毒感染人MSCs，观察感染前后MSCs形态及生长周期的变化，利用PCR、免疫组织化学染色及W七stem blot鉴定重组腺病毒目的基因表达情况。(5)取兔骼骨和四肢骨，经脱脂、脱钙、去蛋白处理获得骨基质明胶，与腺病毒感染后的兔MSCs共培养，在体外构建组织工程化软骨。并通过组织染色、电镜观察了解细胞在同种异体骨基质明胶上粘附、生长和合成分泌软骨基质成分的情况。(6)制备兔膝关节软骨全层缺损模型，以5’一澳一2’一脱氧尿嚓陡标记的组织工程化软骨移植修复缺损区，同时设缺损模型自行修复组、单纯骨基质明胶修复组和未经腺病毒感染骨髓基质干细胞复合骨基质明胶修复组进行对比。术后1月、3月取材，观察关节面修复情况，了解修复组织中细胞的分化和其合成基质的情况。 结果(1)通过逆转录PCR方法由人胎盘组织扩增得到TGF一邵基因全长，经测序后与Genebank中NMO0066O核昔酸序列同源性大于99常四早医大学博士论文%，且位于信号肤和成熟肤的区域内碱基改变均为简并性改变，即所编码的氨基酸未发生改变。(2)通过采用外源基因特异性引物及p一Shuttie特异性引物进行PCR鉴定证实构建的质粒为携带外源基因的重组腺病毒。经空斑形成实验测得病毒滴度为4x 107p彻ml。(3)经密度梯度离心法分离贴壁筛选后所得到的细胞，通过流式细胞仪检测结果为:细胞表面标志物CD29、CD4;为阳性，CD.4、CD34、CD4，为阴性，符合骨髓基质干细胞特征。(4)腺病毒感染后MSCs形态特征及生长周期的无显著变化，免疫组化染色和W七stem blot可检测出外源基因及其编码蛋白的表达，通过RT-PCR可扩增出H型胶原蛋白片段，细胞培养液中己糖醛酸水平较感染前明显升高。(5)制备得到的骨基质明胶为疏松多孔的海绵样结构，具有一定的韧性和强度。将腺病毒感染的骨髓基质干细胞接种于修剪成一定形状的骨基质明胶上，经组织染色和电镜观察可见细胞贴附于骨基质明胶表面和孔隙内，大量增殖。肌袋实验可在6周时见到培养组织块中有软骨细胞条索和软骨陷窝。(6)在体修复试验显示:软骨缺损模型自行修复组在观察时限内可见缺损区为纤维组织覆盖，表面凹凸不平:单纯骨基质明胶修复组在术后观察期限内虽有发现软骨下骨的重建，但缺损处始终未见类软骨组织覆盖，局部区域可见软骨下骨的裸露;经携带TGF一pl和BMP一7基因的腺病毒感染的骨髓基质干细胞复合骨基质明胶修复组在术后1月时即以类透明软骨组织修复了关节软骨缺损，同时重建了软骨下骨。5’-澳一2’一脱氧尿啼睫免疫组织化学检测发现大量的修复细胞?