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红花,为菊科红花属一年生草本植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥管状花。现代药理研究表明,红花中的醌式查尔酮类化合物为其主要有效部位,红花苷(carthamin)是红花药材的主要有效成分之一。本研究旨在考察红花苷对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)性神经元损伤的保护作用,为其临床应用提供实验依据。 本论文以红花药材为原料,采用碱提酸沉、甲醇萃取、凝胶柱层析等方法进行分离纯化获得红花苷,并通过UV、核磁共振图谱等方法确证了其结构;通过比色法测定了红花红色素(红花苷粗品)的稳定性;通过ABTS等方法考察了红花苷的体外抗氧化活性;采用全反式维甲酸( ATRA)诱导体外培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),使其分化为成熟神经元,以冈田酸(OA)处理复制神经元突触萎缩模型,探究红花苷对冈田酸致Tau蛋白过磷酸化引起神经元损伤的保护作用及机制。 主要研究内容及结果如下: (1)红花药材通过去离子水清洗除杂,经碱提酸沉、离心、冷冻干燥,甲醇萃取浓缩等步骤,再经反复葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析,得到化合物红花苷。经HPLC法测定,其纯度≥98%,最后对化合物进行波谱(UV、1H-NMR、13C-NMR)检测,鉴定该化合物即为红花苷。 (2)通过对红花苷的分析检测方法的研究,确定了红花苷的HPLC测定方法:色谱柱:XB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);色谱条件:流动相:乙腈-甲醇-水(35:10:60)(pH值为3~4);流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;检测波长:518 nm;检测时间20 min。进样量:20μL。经方法学考察,验证此方法稳定可行,重复性好。 (3)以实验室提取所得红花红色素(红花苷粗提物)为样品,通过单因素实验法,对红花红色素稳定性进行了研究,分别考察了温度、pH值、光照、金属离子等因素对其稳定性的影响,研究发现红色素在过酸或过碱溶液中稳定性较差;在pH5~11范围内较稳定;红色素热稳定性较差,高温使其颜色变浅,在偏碱性条件下耐热性优于酸性条件;红色素对光稳定;Fe3+、Fe2+、Cu2+、Al3+等对红花红色素稳定性有明显影响,引起其颜色变浅,稳定性降低,而Ca2+、Zn2+、Mg2+等对其稳定性影响较小。 (4)以实验室提取红花苷为样品,研究了其抗氧化作用,采用ABTS法和FRAP 法测定了红花苷的总抗氧化能力,并分别测定了红花苷对羟自由基(?OH)、超氧阴离子(O2-?)、DPPH?自由基的清除能力,实验表明,红花苷能清除自由基,具有较好的抗氧化能力,并且随着浓度增加,逐渐增强。 (5)采用体外培养SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的方法,经10μmol/L ATRA诱导处理4天,诱导细胞分化为成熟神经元,诱导后细胞突触明显增长。随后用40 nmol/L OA处理分化神经元6 h,导致神经元突触明显萎缩,Tau蛋白Ser262位点磷酸化水平明显升高。采用浓度为10~50μmol/L的红花苷与冈田酸共同处理6 h,明显抑制了冈田酸致神经元突触萎缩,且具有浓度依赖性;同时抑制了Tau(Ser262)位点的异常磷酸化,其作用可能与抗氧化活性有关。