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研究背景胰腺癌症状非特异,早期具有高侵袭转移特性,是一种低切除率的实体肿瘤。因此,临床医生面临的主要问题是许多不能切除的胰腺癌患者。到目前为止,由于其恶性程度高,对化疗及放疗不敏感,胰腺癌仍然缺乏有效的治疗措施。一般来说,基于吉西他滨的化疗进展期胰腺癌患者中位生存期大约在6-8月。然而,从研究角度看,胰腺癌细胞维持生存机制研究的进展说明化学治疗仍是最有潜力的治疗。近年来研究发现Hedgehog(Hh)信号途径异常活化是胰腺癌进展过程中主要事件。研究表明,Hh信号通路在胰腺癌中的激活是通过SHh基因上调及核转录因子Gli1调节下游靶基因最终实现的。对高转移性胰腺癌细胞株中通过c DNA微阵列技术对Gli1靶基因进行系统性研究,通过对靶基因仔细分析,发现Hh信号通路下游复杂分子网络调节细胞生存,并提示BIRC3能显著抑制凋亡或许是一关键节点。研究并阐明胰腺癌细胞中Gli1-依赖性BIRC3通路维持细胞生存的这一关键节点的具体机制,对寻找胰腺癌可能的潜在治疗靶点具有重要意义。研究目的:1.研究胰腺癌细胞中Hh信号通路关键元件过表达及抑制情况下BIRC3的变化,探讨Hh信号通路调节BIRC3基因转录效果。2.研究Hh信号通路转录因子Gli1与BIRC3启动子可能结合位点,明确Gli1调节BIRC3基因转录具体机制。3.研究Gli1-依赖性BIRC3通路不同情况下胰腺癌细胞增殖和凋亡情况,探讨Gli1-依赖的BIRC3与胰腺癌细胞生存之间的关系。研究方法:1.构建SHh过表达/Gli1-shRNA干扰慢病毒载体,转染胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC3,Panc-1,荧光定量PCR检测Hh通路中SHh过表达和Gli1干扰时各胰腺癌细胞中SHh、Gli1以及BIRC3mRNA的表达。2.从真核生物启动子数据库寻找并下载人源BIRC3启动子序列,生物信息学方法分析Gli1增强子与BIRC3启动子区可能结合位点,SHh过表达/Gli1-shRNA干扰慢病毒载体转染胰腺癌细胞As PC-1,染色质免疫共沉淀(XChIP-PCR)和双荧光素酶基因报告分析Gli1与BIRC3基因结合具体位点。3.胰腺癌细胞AsPC-1,分别经SHh过表达/Gli1-shRNA干扰/si BIRC3后,荧光定量PCR检测SHh、Gli1、BIRC3及PNCAmRNA变化,western blot检测SHh、Gli1、BIRC3及PNCA蛋白变化;MTT法检测转染前后细胞增殖能力变化,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,并进行各组细胞caspase-3活性检测。研究结果1.三种胰腺癌细胞中,SHh过表达时,SHh、Gli1、BIRC3mRNA水平同步升高,Gli1干扰时SHhmRNA无明显升高,随Gli1mRNA表达下降,BIRC3mRNA水平同步下降,说明BIRC3mRNA水平与SHh-Gli1信号途径活化呈正相关。2.生物信息学分析显示BIRC3启动子区有3个位点与标准Gli1增强子序列“GACCACCCA”配对率达89%,染色质免疫共沉淀结果显示Gli1抗体能富集BIRC3启动子,提示Gli1与BIRC3启动子在细胞内存在特异性结合;SHh过表达时荧光素酶活性随Gli1基因表达增加而升高,Gli1干扰时各位点荧光素酶活力无显著变化,而SHh过表达位点2和3则荧光素酶活力存在明显升高提示位点2和位点3是Gli1与BIRC3启动子区的可能结合位点。3.5组胰腺癌As PC-1细胞经荧光定量PCR及western blotting检测显示,随SHh/Gli1mRNA及蛋白表达增加,BIRC3、PCNA的mRAN及蛋白水平显著增加,敲除BIRC3这种趋势显著逆转;MTT细胞增殖实验显示,SHh过表达后细胞增殖增强,Gli1干扰后细胞增殖减弱;si BIRC3后显著逆转SHh过表达诱导的细胞增殖反应;流式细胞术检测细胞凋亡显示,Gli1干扰后细胞凋亡率显著增加,SHh过表达细胞凋亡率变化不明显,siBIRC3后细胞凋亡率显著增加;caspase-3活性检测结果显示,Gli1干扰后caspase-3活性明显增加;SHh过表达后caspase-3活性降低,siBIRC3后caspase-3活性则明显升高。研究结论1.Gli1通过顺式作用元件促进BIRC3转录。2.SHh-Gli1信号途径促进胰腺癌细胞生存部分通过这种Gli1依赖性BIRC3模式实现的。