卵巢癌是妇科肿瘤中一种发病率高、致死率高的恶性肿瘤。放疗是其治疗的主要手段之一，但卵巢癌与宫颈癌不同，具有辐射抵抗性，使治疗效果不理想。研究表明受照射的细胞损伤修复能力和细胞周期调控是影响辐射敏感性的两个主要因素，射线对肿瘤细胞的杀伤效应主要是造成DNA损伤。损伤的DNA激活损伤应答激酶ATM、ATR、DNA-PK，后者激活细胞周期检查点CHK1、CHK2，阻滞细胞周期进程，修复损伤的DNA。DNA-PK是DNA损伤识别、修复的关键酶，决定损伤细胞的转归。DNA-PK修复错误，DNA变异或诱导细胞进入凋亡程序，损伤的DNA修复成功，细胞可进行正常的生命活动。因此探讨卵巢癌与宫颈癌对辐射产生不同敏感性机制很重要。本研究以shRNA干扰DNA-PK和CHK1在卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞凋亡情况、细胞周期变化及其ATM信号传导途径中DNA-PK和CHK1等分子表达的变化，探讨其辐射敏感性差异的机制，为卵巢癌治疗提供新的途径。本实验研究内容如下：1、DNA-PK shRNA和CHK1shRNA的构建及有效干扰载体的筛选方法：根据人DNA-PK和CHK1在GenBank登录号HSU34994、AF016582，选择CDS区，应用shRNA设计软件，选择DNA-PK和CHK1干扰RNA的靶点，即DNA-PK1160、1888、2995、5297，CHK1140、590、617、632，设计shRNA，分别构建4个shRNA载体，并以无关序列构建对照载体shNC。经限制性内切酶PstⅠ、BamHⅠ和测序鉴定后，shRNA载体以脂质体Lipofectimine2000介导转染Skov3，激光共聚焦显微镜观察转染情况。RT-PCR检测转染细胞DNA-PKmRNA、CHK1mRNA的表达，免疫组化检测转染细胞DNA-PK、CHK1蛋白的表达，以筛选有效的shRNA载体。结果：(1)经限制性内切酶PstⅠ、BamHⅠ酶切鉴定及测序分析证实，以DNA-PK和CHK1为靶分别构建的4个shRNA载体是正确的。(2)激光共聚焦显微镜下观察，所构建的shRNA可有效转染Skov3细胞，根据荧光细胞数可判断转染效率约为50%～60%。(3)RT-PCR及免疫组化检测转染细胞DNA-PK和CHK1的表达，pGPU6/GFP/Neo/DNA-PK-5297、pGPU6/GFP/Neo/CHK1-617转染组DNA-PK和CHK1mRNA及蛋白质表达量下降，为有效shRNA载体。因此选择pGPU6/GFP/Neo/DNA-PK-5297、pGPU6/GFP/Neo/CHK1-617进行后续实验，分别命名为DNA-PK shRNA-5297、CHK1shRNA-617。结论：(1)成功构建了针对DNA-PK和CHK1基因各4个靶点的shRNA表达载体。(2)shRNA载体可有效转染Skov3细胞，并可沉默DNA-PK和CHK1的表达，因此应用RT-PCR和免疫组化筛选出有效的shRNA表达载体DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617。2、辐射诱导卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞凋亡的差异方法：以脂质体Lipofectimine2000介导转染DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617后20h，Skov3和Hela细胞分别接受X-射线照射。照射采用飞利浦深部X-线治疗机，剂量率0.287Gy/min。X-射线照射前用PBS洗细胞，加2ml PBS后进行照射；照射后，立即更换新鲜的完全培养基，继续培养4h或28h，即转染后24h或48h收集细胞，PBS洗3次，每次离心800rpm，5min。加5μl AnnexinV染色10min，PBS洗3次，再加PI10μl，混匀，冰浴30min，PBS洗3次。BD FACSCalibur流式细胞仪检测、分析细胞凋亡，应用CellQuest软件。采用SPSS14软件进行统计分析，t检验分析各组间差异及Skov3细胞和Hela细胞间的FC差异，FC是处理组与对照组的比值。结果：(1)经0、2、4、6、8、10Gy X-射线照射的Skov3细胞和Hela细胞，流式细胞仪分析其凋亡百分数显示Skov3细胞凋亡率分别是1.5%、2.18%、2.9%、4.67%、5.6%、12.5%，Hela细胞凋亡百分数分别是1.1%、19.79%、39.3%、56.7%、70.1%、76.2%。因此在本研究中选择2Gy作为X射线照射剂量。(2)将DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617以脂质体介导分别转染Skov3细胞，X-射线照射后4hr Skov3细胞DNA-PK shRNA-5297、CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组凋亡百分数分别是22.53%±2.41%、21.53%±2.51%、24.80%±3.20%；与shNC照射组相比，有显著性差异（t=5.360，p<0.001；t=4.837，p<0.001；t=5.587，p<0.001）。DNA-PKshRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组细胞凋亡百分数虽然高于DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617转染组，但无显著性差异。28hr的凋亡百分数分别是13.32%±3.63%、15.30%±2.57%、18.91%±2.81%；与shNC照射组相比，有显著性差异（t=2.524，p=0.03；t=4.518，p<0.001；t=6.705，p<0.001）。DNA-PKshRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组细胞凋亡百分数显著高于DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617转染组（t=2.981，p=0.014；t=2.323，p=0.043）。(3)DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617以脂质体介导分别转染Hela细胞，流式细胞术分析结果显示，X-射线照射后4hr Hela细胞DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组细胞凋亡百分数分别是22.28%±3.13%、19.81%±3.16%、25.99%±4.00%。DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组与shNC照射组相比，有显著性差异（t=2.82，p=0.020）；DNA-PK shRNA-5297、CHK1shRNA-617与shNC照射组相比，无显著性差异（t=1.870，p=0.091；t=0.969，p=0.355）。DNA-PKshRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组细胞凋亡百分数显著高于CHK1shRNA-617转染组（t=2.87，p=0.018），虽然高于DNA-PK shRNA-5297转染组，但无显著性差异。28hr的凋亡百分数分别是26.99%±5.28%、26.56%±3.28%、28.90%±3.45%；DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染组与shNC照射组相比，有显著性差异（t=2.421，p=0.036），另两组与shNC照射组相比，无统计学意义。(4)2Gy X-射线照射后4hr或28hr Skov3细胞凋亡率明显低于Hela细胞（t=15.22，p<0.001；t=6.83，p<0.001）。提示在相同辐射剂量照射时Skov3细胞的敏感性低于Hela细胞。而转染DNA-PK shRNA-5297、CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617的Skov3细胞在X-射线照射后4hr或28hr，其凋亡率明显高于Hela细胞。结论：(1)Skov3细胞对辐射不敏感，相同辐射剂量照射时Skov3细胞的敏感性低于Hela细胞，与Hela细胞的辐射敏感性存在差异，可作为卵巢癌和宫颈癌的细胞模型依据。(2)DNA-PK和CHK1干扰RNA可提高Skov3细胞对辐射的敏感性。3、卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞辐射敏感性差异的细胞周期阻滞的研究方法：同2。结果：(1) Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后4hr和28hr进入G2期的Skov3细胞的比例分别为19.68%±3.69%、12.52%±1.45%，显著高于假照射组（t=3.680，p=0.005；t=7.873，p<0.001）。Hela细胞4hr和28hr分别为14.09%±2.84%、11.55%±2.89%，显著高于假照射组（t=4.826，p=0.001；t=2.756，p=0.020）。4hr时Skov3细胞G2期阻滞明显低于Hela细胞（t=2.482，p=0.032），28hr却显著高于Hela细胞（t=8.458，p<0.001）。(2)转染DNA-PK shRNA-5297的Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后4h及28h，进入G2期的细胞比例虽然明显高于DNA-PK shRNA-5297转染的假照射组，但与转染shNC的照射组比较无差异。(3)转染CHK1shRNA-617的Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后4hr及28hr，进入G2期的Skov3细胞比例分别为15.84%±2.19%、5.72%±1.60%，显著低于转染shNC的照射组（t=2.469，p=0.033；t=7.163，p<0.001）。而进入G2期的Hela细胞的比例分别为10.42%±1.38%、9.01%±2.19%，明显低于转染shNC的照射组（t=4.431，p=0.001；t=3.026，p=0.013）。(4)转染DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617的Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后4hr，进入G2期的Skov3细胞比例为16.14%±1.97%，明显低于转染shNC的照射组（t=2.347，p=0.041），与DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染的假照射组比较有差异（t=2.777，p=0.020）；28hr时进入G2期的Skov3细胞比例是7.44%±1.99%，也明显低于转染shNC的照射组（t=4.423，p=0.001），与DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染的假照射组比较有显著性差异（t=3.798，p=0.003）。而4hr进入G2期的Hela细胞的比例为10.12%±1.83%，明显低于转染shNC的照射组（t=4.431，p=0.001），与DNA-PK shRNA-5297和CHK shRNA-617转染的假照射组比较差异显著（t=6.810，p<0.001）；28hr进入G2期的Hela细胞的比例为10.15%±1.47%，也明显低于转染shNC的照射组（t=2.497，p=0.032），与DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染的假照射组比较有差异（t=3.561，p=0.005）。转染DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4hr进入G2期的细胞比率为0.87%±0.11%，显著高于Hela细胞（t=2.965，p=0.014），28hr时为0.64%±0.17%，明显低于Hela细胞（t=2.302，p=0.044）。结论：(1)流式细胞术分析结果显示，Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射，均表现出G2期阻滞。(2) DNA-PK shRNA对Skov3细胞和Hela细胞周期或G2期阻滞无明显影响。(3) CHK1shRNA可解除Skov3细胞和Hela细胞G2期阻滞，但转染CHK1shRNA的Skov3细胞在照射后28h阻滞继续解除，而Hela细胞阻滞有所恢复或没表现继续解除，与细胞凋亡百分数变化不一致，推测Skov3细胞存在除CHK1检查点、DNA-PK修复之外的其他检查、修复途径；或Skov3细胞G2期检查点可能过剩或无效，未表现出辐射敏感性。(4)转染DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617可解除Skov3细胞和Hela细胞G2期阻滞，且照射后28hr G2期阻滞继续解除；转染DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617的Skov3细胞X射线照射后4hr，G2期阻滞程度高于Hela细胞，28hr低于Hela细胞。4、卵巢癌和宫颈癌辐射敏感性差异的DNA损伤应答机制的探讨方法：转染、照射方法同2。提取细胞RNA，对RNA定量后，进行RT-PCR。RT-PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，并应用凝胶成像系统进行观察、照相，根据DNAmarker和预测PCR产物大小分析、判断所得PCR产物。结果：(1)进一步证实DNA-PK shRNA-5297、 CHK1shRNA-617可有效沉默DNA-PK、CHK1mRNA的表达。(2)Skov3细胞和Hela细胞在2Gy X射线照射后p53mRNA的表达量增加，但转染DNA-PK shRNA-5297的细胞p53mRNA的表达量接近于正常对照组，而CHK1shRNA-617转染组及DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617共转染组细胞p53mRNA的表达量接近于单纯2Gy照射组，单纯转染DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617对Skov3细胞和Hela细胞p53mRNA的表达无明显影响。(3)2Gy X射线照射后Skov3细胞和Hela细胞CDC25C mRNA的表达量增加，转染DNA-PK shRNA-5297及DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617共转染细胞的CDC25C mRNA的表达量接近于单纯2Gy照射组，而CHK1shRNA-617转染组细胞CDC25C mRNA的表达量接近于正常对照组，单纯转染DNA-PKshRNA-5297、CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617对Skov3细胞和Hela细胞CDC25C mRNA的表达无明显影响。(4)转染CHK1shRNA-617可下调辐射诱导的Skov3细胞和Hela细胞CDC25A mRNA的表达量，转染DNA-PK shRNA-5297及DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617共转染Skov3细胞和Hela细胞的CDC25A mRNA的表达量接近于单纯2Gy照射组，而CHK1shRNA-617转染组细胞CDC25AmRNA的表达量接近于正常对照组。(5)CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染使经受2Gy X射线照射的细胞CDK2mRNA的表达量增加。结论：CHK1shRNA-617、DNA-PK shRNA-5297和CHK1shRNA-617转染使X射线照射的Skov3细胞和Hela细胞CDC25C、CDC25AmRNA的表达量下调、Cdk2的mRNA表达量上调，DNA-PK shRNA-5297可下调辐射诱导的Skov3细胞和Hela细胞p53mRNA的表达，使其下游的p21转录减少，进一步增加了Cdk2-cyclinE复合物活性，最终导致射线造成的周期阻滞解除，增加细胞的凋亡。此推论与前期观察到的细胞凋亡和周期阻滞是一致的。