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脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是脑组织缺血部位恢复血流灌注后,组织损伤迅速加剧的情况。氧化应激和神经炎症与CIRI的病理进程密切相关。NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)是脑缺血/再灌注(ischemia reperfusion,I/R)后活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成的主要来源,脑缺血后产生过量的ROS激活炎症小体诱发炎症反应。核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(NLRP1)炎症小体的过度活化调控炎症因子Interleukin-1β(IL-1β)和Interleukin-16(IL-16)的成熟和分泌。这些炎症因子可进一步诱导细胞粘附分子的表达,使免疫细胞如嗜中性粒细胞和巨噬细胞发生迁移,介导缺血再灌注损伤。人参皂苷Rg1是人参中重要单体成分之一,具有抗炎、抗氧化和神经保护作用。本课题旨在研究脑缺血再灌注损伤中NOX2-NLRP1信号通路的作用及Rg1的干预作用,为脑缺血的临床药物治疗提供新的靶点和思路。目的:研究NOX2介导的NLRP1炎症小体的激活在脑缺血再灌注损伤中的作用,探究人参皂苷Rg1在脑缺血再灌注损伤中的保护作用,为把人参皂苷Rg1开发为安全有效的应用于脑缺血的神经保护药物提供实验依据。方法:1.雄性3月龄昆明小鼠随机分为假手术组、I/R组、I/R+Tempol(50mg/kg)组、I/R+Apocynin(50mg/kg)组、I/R+Rg1(5mg/kg)组、I/R+Rg1(10mg/kg)组,每组5只,小鼠脑缺血模型使用双侧颈总动脉结扎法,分别于缺血前,缺血40min后,再灌注20min后采用激光散斑血流仪监测脑血流变化。2.雄性3月龄昆明小鼠随机分为假手术组、I/R组、I/R+Tempol(50mg/kg)组、I/R+Apocynin(50mg/kg)组、I/R+Rg1(5mg/kg)组、I/R+Rg1(10mg/kg)组,每组9只。通过双侧颈总动脉结扎法制造小鼠脑缺血模型,缺血1小时后再灌注。采用旷场实验检测小鼠运动和探究行为的变化情况;爬杆法检测小鼠神经运动协调能力;采用HE染色法观察小鼠皮层和海马CA1和CA3区神经元病理形态学变化情况;采用尼氏染色法检测小鼠皮层和海马CA1和CA3区尼氏小体的变化情况;DHE荧光法检测小鼠皮层和海马CA1和CA3区活性氧(ROS)的生成情况;Western Blot检测皮层和海马区NADPH氧化酶和NLRP1炎症小体相关蛋白NOX2,p47phox,p22phox,NLRP1,ASC,Caspase-1,IL-1β的表达情况;Western Blot检测皮层和海马区Iba1和MAP2蛋白表达情况。3.PC12细胞OGD/R模型:将实验细胞分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Tempol(50μmol/L)组、OGD/R+Apocynin(50μmol/L)组、OGD/R+Rg1(5μmol/L)组、OGD/R+Rg1(10μmol/L)组。LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶含量;ELISA试剂盒检测细胞上清液中炎症因子IL-1β的表达;DCFH-DA试剂盒检测PC12细胞中活性氧的表达;Annexin V-FITC/PI试剂盒检测PC12细胞凋亡情况;Western Blot检测细胞NADPH氧化酶和NLRP1炎症小体相关蛋白NOX2,p47phox,p22phox,NLRP1,ASC,Caspase-1,IL-1β的表达状况。结果:1.脑血流结果显示:与假手术组相比,I/R模型组缺血后和再灌注20min后脑血流量显著下降。与I/R模型组小鼠比较,Tempol,Apocynin和人参皂苷Rg1(5,10 mg/kg)预处理小鼠脑缺血后和再灌注20 minutes(min)后的血流量显著上升,提示Rg1对改善血流灌注具有明显作用。2.旷场和爬杆实验结果显示:与假手术组相比,I/R模型组小鼠的运动能力和肢体协调能力显著下降。与I/R模型组小鼠比较,Tempol,Apocynin和人参皂苷Rg1(5,10 mg/kg)组小鼠的运动能力和肢体协调能力明显改善。3.DHE结果显示:与假手术组相比,I/R模型组小鼠脑组织皮层和海马CA1,CA3区ROS的产生明显增多。与I/R模型组小鼠相比,Tempol,Apocynin和人参皂苷Rg1(5,10 mg/kg)组小鼠脑组织神经元ROS生成均显著减少,其中Rg1(10 mg/kg)更为显著。4.HE染色结果显示:与假手术组小鼠相比,I/R模型组小鼠脑组织皮层区有明显的病理损伤,大量细胞出现了核仁不清晰、轮廓不清楚、核固缩、核裂变、空泡和坏死的现象。而与I/R模型组小鼠相比,Tempol,Apocynin和人参皂苷Rg1(5,10 mg/kg)给药组小鼠均能明显改善I/R模型组小鼠的病理损伤。5.尼氏染色结果显示,和假手术组相比,I/R模型组小鼠皮层区和海马CA1,CA3区的尼氏小体数量减少,体积缩小,染色变浅。与I/R模型组小鼠相比,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10 mg/kg)预处理组小鼠神经元细胞损伤较轻微,尼氏小体的数量增多,染色较深,说明药物治疗对神经元具有保护作用。6.Western blot结果显示,和假手术组相比,I/R模型组小鼠皮层和海马区的NOX2,p22phox,NLRP1,ASC,IL-1β,Caspase-1表达量显著增加,而p47phox表达无显著变化;与I/R模型组小鼠相比,Tempol和Apocynin预处理对NOX2和ASC的表达无显著影响,对p22phox,p47phox,NLRP1,IL-1β,Caspase-1表达有降低作用(P<0.05);而Rg1(5,10mg/kg)预处理可明显降低I/R模型组小鼠NOX2,p22phox,p47phox,NLRP1,ASC,IL-1β,Caspase-1蛋白的表达。该实验结果表明,Rg1可能下调I/R小鼠脑组织NOX2的表达。7.细胞实验结果中,和对照组相比,OGD/R组细胞出现明显损伤,凋亡细胞增多,活性氧ROS和炎症因子IL-1β释放增多,NOX2,p22phox,p47phox,NLRP1,ASC,IL-1β,Caspase-1蛋白表达量明显增加。和OGD/R组相比,Tempol,Apocynin和Rg1(5,10μmol/L)预处理明显减轻细胞损伤,抑制细胞凋亡和活性氧ROS及IL-1β的释放,下调氧化应激和炎症小体相关蛋白相关蛋白的表达。结论:人参皂苷Rg1能改善小鼠I/R损伤,减轻缺血再灌注导致的氧化应激和炎症反应。其机制可能与人参皂苷Rg1抑制NOX2-NLRP1信号通路有关,为人参皂苷Rg1在脑缺血再灌注损伤的防治中提供了实验依据。