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1目的肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,近年来肺癌的发病率和病死率均迅速上升,其中男性患者中肺癌的死亡率已居首位。其中非小细胞肺癌的发病率在所有肺癌中比例最高。肺癌的发生及发展与肿瘤相关基因的异常表达存在着密切的关系。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作为一种高度保守的蛋白激酶,可以通过整合生长因子和营养信号来调节肿瘤细胞生长,是肿瘤生物调节中的关键性基因。目前mTOR已成为肿瘤治疗的生物靶点。慢病毒介导的RNA干扰是目前公认的最有效的基因沉默手段之一。本文拟通过利用慢病毒介导的RNA干扰技术,以非小细胞肺癌细胞A549为研究对象,以mTOR为目的靶基因。利用MTT、流式细胞术、克隆形成、Transwell及裸鼠体内试验等技术,分别在体外及体内环境中探讨降低mTOR的表达对A549细胞生物学行为的影响。此外通过检测P70S6K, MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1等基因的表达变化,进一步分析mTOR调控肿瘤生物学功能的分子机制。本研究旨在通过以上实验探讨mTOR在肺癌细胞中的作用及其机理,同时为mTOR作为治疗性靶基因在临床方面的应用、为肺癌的基因治疗、基因药物的研制提供必要的实验依据。2方法2.1根据mTOR编码区基因序列,设计合成4条shRNA,并克隆到慢病毒表达载体。转染A549细胞后,应用RT-PCR及western blot检测其干扰效果,并确定干扰效率最好的一条shRNA。最后分别将其包装成带有GFP标签及Puro抗性基因的慢病毒颗粒。2.2体外实验中,将带有GFP绿色荧光标签的慢病毒感染A549细胞。应用MTT、细胞生长曲线、克隆形成、流式细胞术检测A549细胞的增殖和凋亡能力；应用transwell检测细胞侵袭能力；利用western blot检测mTOR的表达降低对P70S6K,MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1蛋白表达的影响。2.3体内实验中,利用带有Puro抗性基因的慢病毒感染A549细胞并获得持续表达mTOR shRNA及对照病毒的稳定细胞株。将获得的稳定细胞株扩增并以107/只的细胞浓度接种裸鼠。接种后对裸鼠的体重及肿瘤形成进行监测,分析mTOR的低表达对A549细胞成瘤性的影响。2.4统计学处理：应用SPSS16.0统计分析软件进行统计学处理,计量资料采用均数士标准差(X±s)表示,多样本均数比较采用方差分析,两两比较采用LSD比较,率的比较采用X2检验等进行统计学处理,显著性检验水准取a=0.05。3结果3.1成功将四条mTOR shRNA克隆至pSIHl-H1-copGFP慢病毒克隆载体,分别为Sh-mTOR-6506, Sh-mTOR-3266, Sh-mTOR-4995, Sh-mTOR-6216。分别转染A549细胞后,通过RT-PCR及western blot验证mTOR的表达水平后发现,Sh-mTOR-6216对A549细胞中mTOR的抑制率可达70%以上,干扰效率明显高于其他干扰组及对照载体组。然后成功包装含有该shRNA序列的带有GFP荧光标记的慢病毒lenti-GFP-mTOR及Puro抗性基因的慢病毒lenti-Puro-mTOR,分别用于以下的体外实验及体内试验。3.2体外实验中,利用lenti-GFP-mTOR慢病毒感染A549细胞。感染后48h,MTT检测结果显示：空细胞组,对照慢病毒组及lenti-GFP-mTOR组在570nm的吸光度值分别为：0.687±0.103,0.667±0.037,0.356±0.059。lenti-GFP-mTOR组的细胞活力较其它两组有明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；对照病毒组与空细胞组之间无明显差异,不具有统计学意义。3.3病毒感染后,A549细胞克隆形成结果显示：空细胞组克隆形成的数量为63±10.536,对照病毒组克隆形成的数量为59.333±9.713,lenti-GFP-mTOR组克隆形成的数量为16±4.583。以上数据说明mTOR的表达降低能够有效地抑制A549细胞克隆形成能力与其余两组相比明显变弱,形成的克隆数量明显变少,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照病毒组与空细胞组之间虽略有差异,但不具有统计学意义。3.4Transwell实验显示,病毒感染后24h,空细胞组穿膜细胞数为124.333±6.110,对照病毒组穿膜细胞数为109.333±11.504,lenti-GFP-mTOR组穿膜细胞数为18±5.568。lenti-GFP-mTOR穿膜细胞数较空细胞组及对照病毒组相比明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照病毒组穿膜细胞数较空细胞组有所下降,但不具有统计学意义。3.5流式细胞术检测细胞凋亡结果显示：空细胞组早期凋亡细胞占有比例为0.25%,对照病毒组早期凋亡细胞占有比例为3.2%,lenti-GFP-mTOR组早期凋亡细胞占有比例为62.3%。该实验数据提示,利用慢病毒降低A549细胞中mTOR的表达后,lenti-GFP-mTOR能够有效地促进细胞凋亡,细胞凋亡数量较空细胞组及对照病毒组相比明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果显示：感染lenti-GFP-mTOR后,相比较空细胞组及对照病毒组,细胞出现G1期阻滞。3.6病毒感染后48h,应用western blot检测A549细胞中mTOR, P70S6K, MT1-MMP, HIF-1a, VEGFA, cyclinD1蛋白的表达变化。结果显示：mTOR的表达降低能够抑制P70S6K, MT1-MMP, HIF-la, VEGFA and cyclinD1等基因的蛋白表达。3.7体内试验中,将lenti-Puro-mTOR组稳定细胞株、对照病毒组稳定细胞株及空细胞接种于裸鼠体内。裸鼠处死后观察肿瘤大小。结果显示：空细胞组肿瘤大小为72.767±14.677mm3,对照病毒组肿瘤大小为62.625±6.358mm3,lenti-Puro-mTOR组肿瘤大小为28.308±3.521mm3。lenti-Puro-mTOR组形成的肿瘤体积明显小于空细胞组及对照病毒组,差异具有统计学意义(P<0.05)。对照病毒组肿瘤体积小于空细胞组,但不具有统计学意义。4结论4.1成功构建分别带有绿色荧光标记及嘌呤霉素抗性的特异性靶向mTOR shRNA的慢病毒,将其感染A549细胞后,可有效降低mTOR的蛋白表达。4.2体外实验证实利用慢病毒靶向携带mTOR RNA干扰技术降低A549细胞中mTOR的表达,可以抑制细胞的增殖、转移,以及促进细胞的凋亡。通过western blot实验发现,mTOR的低表达导致其下游一些分子的表达降低,包括P70S6K、HIF-1、MT1-MNP、VEGFA、cyclinD1。4.3成功建立A549细胞裸鼠模型并应用于裸鼠体内实验。实验结果显示降低mTOR的表达可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长。