脑出血是一种常见病、多发病,死亡率、致残率很高。脑出血后血肿周围脑组织会出现一系列的病理变化,如脑组织水肿、缺血等。近年来有关脑出血病理机制的研究从未间断,但鲜有重大突破。很早以前即有研究发现脑出血后血肿周围组织内有“点状出血”,这些“点状出血”病灶常呈环状围绕在血管周围,故又称为“环状出血”。“环状出血”的病理机制一直未被探明,一般认为是由于血肿压迫导致静脉回流受阻、出现脑组织淤血性梗死,小血管破裂出血所致。我们的前期研究发现脑出血血肿周围组织内存在一种独特的病理现象—“管涌现象”,即流体状态的血液顺着压力差沿着血管周围间隙(VRS)和神经纤维周围间隙等疏松的组织间隙向远端扩展。“环状出血”其实就是血肿沿血管周围间隙向外扩展所致。“管涌现象”可能与血肿远隔效应、淋巴滞留性脑水肿、继发性蛛网膜下腔出血和继发性脑室出血等脑出血的一系列病理现象有关,有待于进一步研究证实。第一章预置管两次注射自体动脉血法构建大鼠尾状核脑出血动物模型的实验研究研究目的采用预置管两次注射自体动脉血法制备大鼠尾状核脑出血动物模型,与非预置管法制备的大鼠尾状核脑出血动物模型进行对照研究,探讨预置管技术抑制针道反流,改善脑出血动物模型稳定性的可行性。材料和方法采用配对实验设计。取健康雄性SD大鼠12对,每对大鼠体重相近(250±10g),同窝别,喂养条件相同。随机分入预置管组和非预置管对照组,每组各12只。预置管组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后在立体定向仪下向左侧尾状核中心置管,术后24 h从股动脉抽取自体血50μL,经预置管分两次缓慢注入尾状核,并密闭导管；非预置管对照组大鼠在立体定向仪下向左侧尾状核中心置管后立即分两次缓慢注射自体动脉血50μL。所有大鼠注射自体动脉血24 h后再次腹腔麻醉,4%多聚甲醛灌注固定并处死,剥取完整脑组织,4%多聚甲醛浸泡48 h后作脑组织序列切片,片厚2 mm,大体观察并照相。然后进行冰冻切片,HE染色后镜下观察并照相。结果两组大鼠左侧尾状核内均可见血肿形成,预置管组的平均血肿容量(25.1±0.5)μL,大于对照组(24.2±0.7)μL,具有显著性差异(p<0.05)。预置管组大鼠血肿容量离散系数为2.0%,明显低于对照组大鼠血肿容量离散系数2.9%。预置管组血肿形态较规则,呈圆形,占位效应较明显。第二章脑出血后血肿内有形成分“管涌现象”的病理学研究研究目的采用异硫氰酸(FITC)荧光探针标记红细胞,探讨脑出血后不同时间血肿内有形成分“管涌现象”的分布特点。材料和方法采用预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠尾状核脑出血动物模型。取SD雄性大鼠40只,体重250±10g,随机分为6个实验组、2个假手术对照组(1h组、3d组),每组各5只。其中实验组共6组：1h组、6h组、24h组、3d组、7d组和14d组。FITC标记自体动脉血的制备：各实验组大鼠从股动脉抽血。采用FITC标记自体红细胞(FITC-RBC),用自体血清重悬至原体积,取此FITC标记的自体动脉血50μL用来制备脑出血动物模型。脑出血动物模型的制备：采用预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠脑出血动物模型。各组大鼠在立体定向仪下向左侧尾状核中心预置管。各实验组大鼠在置管术后24h经预置管注射预先制备的FITC标记自体动脉血50μL制备脑出血动物模型；假手术对照组大鼠仅穿刺进针至左侧尾状核中心,不注血。组织切片制备及其荧光和HE染色观察：各实验组大鼠在模型制备后的相应时间点腹腔麻醉,灌注固定并处死。假手术对照组大鼠术后1h、3d腹腔麻醉、灌注固定并处死。各组大鼠剥离出脑组织以及双侧颈深淋巴结,冰冻切片后在荧光显微镜下观察并照相。采用波长为460-490 nm的蓝色光激发。荧光照相后进行常规HE染色,并在光学显微镜下观察并照相。将同一部位荧光图像及HE图像输入Photoshop CS4,手工配准后进行图像叠加并进行观察分析。结果FITC-RBC主要分布在血肿周围组织内,沿血管周围间隙和神经纤维周围间隙广泛分布,常扩散至同侧胼胝体。同侧基底节和大脑皮层内的VRS内也可见散在分布,脑干及对侧大脑半球仅在VRS内可见少量FITC-RBC散在分布。血肿周围组织内可见FITC-RBC裂解后释放的游离FITC,血肿形成时间越长越多。游离FITC分布范围比FITC-RBC广泛,在双侧大脑半球和脑干内的VRS内均可见广泛分布。血肿形成1h血肿外各脑区的VRS内开始出现含有黄色荧光颗粒的吞噬细胞,血肿周围较多。随时间的延长逐渐增多,且颜色逐渐加深呈黄褐色。14d时遍及脑内所有部位的VRS内。血肿形成1h后双侧颈深淋巴结内均可见FITC-RBC和游离FITC分布,双侧分布情况相似,主要分布在淋巴窦内,此时淋巴小结的生发中心内未见FITC-RBC和游离FITC。随着时间的推移,FITC-RBC逐渐减少,但游离FITC和含有黄色荧光颗粒的吞噬细胞明显增多。假手术组大鼠脑组织及双侧颈深淋巴结内均未见颗粒状荧光物质分布。第三章脑出血后血肿内无形成分“管涌现象”的病理学研究研究目的采用四甲基罗丹明(TAMRA)荧光探针标记的牛血清白蛋白(TAMRA-BSA),探讨脑出血后不同时间段血肿内无形成分“管涌现象”的分布特点。材料和方法采用预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠尾状核脑出血动物模型。取SD雄性大鼠40只,体重250±10g,随机分为6个实验组、2个假手术对照组(1h组、3d组),每组5只。其中实验组共6组：1h组、6h组、24h组、3d组、7d组和14d组。TAMRA荧光探针标记的自体动脉血的制备：采用TAMRA荧光探针标记的牛血清白蛋白(TAMRA-BSA),掺入大鼠自体动脉血中使TAMRA-BSA在动脉血中的终浓度为40mg/ml,取此TAMRA标记的自体动脉血50μL制备脑出血动物模型。脑出血动物模型的制备：采用预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠脑出血动物模型。各组大鼠在立体定向仪下向尾状核中心预置管。各实验组大鼠术后24 h采用TAMRA-BSA标记的自体动脉血50μL制备脑出血动物模型；假手术对照组大鼠仅进针至大鼠尾状核,不注血。组织切片制备及其荧光和HE染色观察：各实验组大鼠在模型制备后的相应时间点腹腔麻醉、灌注固定并处死。假手术对照组大鼠术后1 h、3d腹腔麻醉、灌注固定并处死。各组大鼠剥离出脑组织以及双侧颈深淋巴结,冰冻切片后在荧光显微镜下观察并照相。采用波长为510-550 nm的绿色光激发,荧光照相后进行常规HE染色,并在光学显微镜下观察并照相。将同一部位荧光图像及HE图像输入Photoshop CS4,手工配准后进行叠加并进行分析。结果TAMRA-BSA在脑组织内广泛分布,遍及脑内所有部位的VRS内。除在血肿及血肿周围组织内存在大量TAMRA-BSA颗粒外,TAMRA-BSA颗粒还大量分布于血肿同侧基底节区和皮层的VRS内,脑干和血肿对侧大脑半球内的VRS内也可见TAMRA-BSA颗粒散在分布。TAMRA-BSA颗粒也可以沿神经纤维周围间隙扩散,但距离较近,仅能扩散至血肿周围组织内,较常见的部位为血肿周围的神经纤维束和胼胝体。血肿形成后不同时间段各脑区TAMRA-BSA颗粒的分布变化不明显。1h后病灶同侧各脑区内即可见TAMRA-BSA颗粒在血管周围间隙广泛分布,血肿周围的神经纤维周围间隙内也可见TAMRA-BSA颗粒分布。其他各时间段TAMRA-BSA颗粒分布情况大致相同。血肿形成1h后双侧颈深淋巴结内均可见含TAMRA-BSA荧光颗粒,双侧分布情况相似,主要分布在淋巴窦内,淋巴小结的生发中心内也可见含有TAMRA-BSA荧光颗粒的吞噬细胞分布。不同时间段各组AMRA-BSA荧光颗粒在颈深淋巴结内的分布情况相似。血肿形成6h后,血肿内开始出现含黄色荧光颗粒的吞噬细胞,此时包括双侧大脑半球和脑干等各脑区的VRS内也可见含有黄色荧光颗粒的吞噬细胞,血肿周围较多,而且随时间的延长逐渐增多,颜色逐渐加深呈黄褐色。假手术组大鼠脑组织及双侧颈深淋巴结内均未见颗粒状荧光物质分布。第四章“管涌现象”与淋巴滞留性脑病关系的病理学研究研究目的本研究通过FITC标记红细胞、TAMRA标记BSA,对脑出血后“淋巴滞留性脑水肿”进行了初步研究,旨在探明脑出血后“管涌现象”与“淋巴滞留性脑水肿”的关系。材料和方法采用预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠尾状核脑出血动物模型。SD雄性大鼠70只,体重250+10g(由南方医科大学实验动物中心提供),随机分为6个TAMRA实验组、6个FITC实验组和2个假手术对照组(1 h组、3 d组),每组各5只。6个TAMRA实验组分为：TAMRA-1 h组、TAMRA-6 h组、TAMRA-24 h组、TAMRA-3 d组、TAMRA-7 d组和TAMRA-14 d组。6个FITC实验组分为：FITC-1 h组、FITC-6 h组、FITC-24h组、FITC-3 d组、FITC-7 d组和FITC-14 d组。FITC标记自体动脉血的制备：各实验组大鼠经股动脉抽血。采用FITC标记自体红细胞(FITC-RBC),用自体血清重悬至原体积,取此FITC标记的自体动脉血50μL用来制备脑出血动物模型。TAMRA荧光探针标记的自体动脉血的制备：采用TAMRA荧光探针标记的牛血清白蛋白(TAMRA-BSA),掺入大鼠自体动脉血中使TAMRA-BSA在动脉血中的终浓度为40 mg/ml,取此TAMRA标记的自体动脉血50μL制备脑出血动物模型。脑出血动物模型的制备：采用预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠脑出血动物模型。各组大鼠在立体定向仪下向尾状核中心预置管。各实验组大鼠置管术后24 h经预置管注射预先制备的FITC标记自体动脉血以及TAMRA标记的自体动脉血50μL制备脑出血动物模型；假手术对照组大鼠仅穿刺进针至尾状核中心,不注血。组织切片制备及其荧光和HE染色观察：各实验组大鼠在模型制备后的相应时间点腹腔麻醉,灌注固定并处死。假手术对照组大鼠术后1h、3d腹腔麻醉,灌注固定并处死。各组大鼠剥离出脑组织,冰冻切片后在荧光显微镜下观察并照相。各TAMRA实验组采用波长为510-550 nm的绿色光激发,各FITC实验组采用波长为460-490 nm的蓝色光激发。荧光照相后进行常规HE染色,并在光学显微镜下观察并照相。将同一部位荧光图像及HE图像输入Photoshop CS4,手工配准后进行图像叠加并进行观察分析。结果血肿形成1h后,血肿周围脑组织VRS开始扩大,内有淋巴液潴留,周围脑组织开始出现水肿。3d达到高峰,此时部分血管周围间隙呈气球样改变。扩张的VRS周围脑组织水肿明显,VRS扩张程度越严重其周围脑组织水肿越明显。7d后扩张的VRS开始逐渐缩小,14d后VRS内淋巴潴留现象基本消失,周围脑组织水肿也基本消褪。没有明显淋巴液潴留的VRS周围脑组织水肿不明显或仅有轻度水肿,即使在3d淋巴潴留达到高峰期间也是如此。脑组织水肿的程度与VRS内淋巴液潴留的程度明显正相关。大部分扩张的VRS内均可见TAMRA或FITC荧光颗粒。但并不是所有含TAMRA或FITC荧光颗粒的VRS均有淋巴液潴留,大量含有TAMRA或FITC荧光颗粒的VRS内并未见到淋巴液潴留,周围脑组织的水肿也不明显。同时,某些伴有周围脑组织水肿的扩张的VRS中并不含TAMRA或FITC荧光颗粒。假手术对照组脑组织无扩张的VRS, VRS也没有TAMRA或FITC荧光颗粒。结合脑组织水肿的程度与VRS内淋巴液潴留的程度明显正相关的现象,提示淋巴液潴留是脑出血血肿周围组织水肿的最主要原因。结论1、与传统的非预置管两次注射自体动脉血法比较,预置管两次注射自体动脉血法制备的大鼠尾状核脑出血动物模型血肿形态规则、容量稳定、反流量少,是建立稳定的脑出血动物模型的有效手段。2、脑出血发生后,“管涌现象”即开始出现。3、血肿内有形成分的“管涌现象”主要发生在VRS内,可扩散至整个中枢神经系统,神经纤维周围间隙内的“管涌现象”仅见于血肿周围组织内。4、血肿内无形成分的“管涌现象”分布范围远远超过有形成分,可发生在整个中枢神经系统的VRS内,神经纤维周围间隙内的“管涌现象”则主要见于血肿周围组织内。5、血肿内的有形成分红细胞裂解后可释放出无形成分,沿VRS_远距离扩散,使血肿内有形成分的“管涌现象”分布范围逐渐扩大。6、血肿内无形成分的“管涌现象”在血肿形成后即达到高峰,并扩散至整个中枢神经系统。7、“管涌现象”是血肿吸收的主要途径之一。血肿析出的大分子物质主要通过VRS通过颈深淋巴结被吸收入血。8、血肿形成1h后血肿周围脑组织即开始出现“淋巴滞留性脑水肿”,3d达到高峰,7d后开始逐渐减轻,14d后基本消失。9、“管涌现象”与“淋巴滞留性脑水肿”密切相关,脑出血后不同时期“管涌现象”的演变导致了淋巴滞留性脑水肿动态变化。10、脑出血后脑组织水肿的最主要原因可能是淋巴液潴留而不是血肿毒性物质的作用。11、借助“管涌现象”,血肿内的毒性物质的作用范围明显增大,可能是血肿远隔效应的主要机制。12、“管涌现象”可能导致了血肿形态不规则。13、“管涌现象”与脑出血后继发性脑室出血和蛛网膜下腔出血有关。