一、研究背景生物体内的蛋白质绝大多数都是以糖蛋白的形式存在。位于高尔基体内的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在糖蛋白的合成中起关键作用。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶至少有6种,其中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V)是目前研究最多的。其主要功能是在核心五糖基础上形成多分支结构,将供体底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)中的GlcNAc (Gn)糖基转移至N-聚糖五糖核心的两个甘露糖上,催化N-糖链的β1,6分支的形成。GnT-V影响肿瘤恶性生物学行为的机制有两种：一是做为糖基转移酶,其异常表达可引起细胞糖蛋白β1,6分支结构的异常糖基化,从而影响着肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力。二是作为高尔基体酶,可分泌到血液循环中,这种分泌形式的GnT-V可引起肿瘤血管的生成。目前的研究表明在结肠癌和乳腺癌中,GnT-V的表达量和肿瘤的恶性生物学行为呈正相关；然而在非小细胞肺癌中,GnT-V的表达量越低,肿瘤的恶性程度反而越高。以上的研究表明在不同的肿瘤细胞中,GnT-V扮演着不同的角色。鼻咽癌在我国南方地区的发病率极高,严重影响了我国南方地区人民的生活质量。影响鼻咽癌恶性生物学行为的因素很多,包括EB病毒的感染,某些分子结构的改变,例如：Bmi-1蛋白,基质金属蛋白酶-19等。约30%-40%的进展期鼻咽癌病人会发生局部复发和远处转移。鼻咽癌分为WHOⅠ,Ⅱ和Ⅲ型,其中97%的病例属于WHOⅢ型,放射治疗是Ⅲ型鼻咽癌的主要治疗方式。但是由于个体差异,并不是所有鼻咽癌细胞都对放射治疗敏感,有些鼻咽癌细胞放射敏感性低,治疗效果差。已经发现的和鼻咽癌细胞放射敏感性有关的预测分子有Raf激酶抑制蛋白,GRP78蛋白和p53基因等。但是目前为止尚未有一个公认的标志性分子能预测鼻咽癌细胞的放射敏感性。虽然很多研究表明GnT-V和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但是目前尚未有报导鼻咽癌细胞和GnT-V之间关系的研究。在本实验中,我们利用RNA干扰技术,下调鼻咽癌细胞CNE-2中GnT-V的表达量,得到了低表达GnT-V的细胞株CNE-2 GnT-V/2224;通过对比鼻咽癌细胞和低表达GnT-V的鼻咽癌细胞的恶性生物学行为,研究GnT-V和鼻咽癌细胞增殖、侵袭等生物学特征的关系。另外,我们还研究了GnT-V对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响,并对其可能内在机制进行了讨论。二、研究目的利用RNA干扰技术,下调鼻咽癌细胞CNE-2中GnT-V的表达量,观察GnT-V对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、转移、放射敏感性的影响,为鼻咽癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。三、实验方法1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA质粒的构建及鉴定已由本课题组成员完成。pGPU6/GFP/Neo GnT-V/1564和pGPU6/GFP/Neo GnT-V/2224为靶向抑制GnT-V表达的质粒；pGPU6/GFP/Neo GnT-V/NC为对照质粒。2、细胞培养和转染人鼻咽癌细胞株CNE-2在37℃5%C02条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2-3次。细胞培养至对数生长期,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入CNE-2细胞。利用G418筛选转染成功的细胞。3、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干扰效果检测a.qRT-PCR测定GnT-V mRNA用Trizol提取对数生长期细胞中总RNA,按实时荧光定量RT-PCR试剂盒说明进行实验。GnT-Ⅴ上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG 3’,下游引物为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA 3’。β-actin作为内参,上游引物为5’GAAACTACCTTCAACTCCATC 3’下游引物为5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’。合成cDNA的反应条件为：15分钟37℃,5秒85℃。PCR的反应条件为：预变性95℃30秒,PCR反应95℃5s,60℃20s(40个循环),溶解曲线分析95℃0秒,65℃15秒,95℃0秒。计算出2-ΔΔCt,代表每组mRNA的相对表达量。每组重复例数为3。b.Western blot检测GnT-Ⅴ蛋白表达提取总蛋白,测定蛋白浓度,吸取总蛋白,去离子水补至20μL,加入上样buffer煮沸5min,离心后吸取25μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,7%脱脂奶粉+3%的BSA在37℃封闭2h, TBST洗膜后用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗体(1：200)、羊抗人GAPDH蛋白单克隆抗体(1：1000)4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1:4000),IgG(1: 6000),室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光x线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Quantity One软件分析条带灰度值,用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ蛋白的相对表达量。每组重复例数为3。4、CCK-8检测下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞增殖能力的影响取对数生长期的待测细胞,CCK-8法测量不同时间点的OD450nm值(0h、24h、48h、72h、96h)。计算出细胞生长分数,绘制生长曲线。实验分为CNE-2组,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组,CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组,每组重复例数为12。5、划痕愈合实验检测下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞迁移能力的影响取对数生长期的待测细胞,接种于24孔板,培养至细胞呈单层贴壁生长状态。用100ul的枪头分别在各组单细胞层上划痕,用含10% FBS的培养基继续培养以使划痕愈合。分别于划痕后0h、12h、24h拍照,观察划痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前两侧细胞层距离-愈合后两侧细胞层距离)/愈合前两侧细胞层距离]×100%。实验分为CNE-2组, CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组,每组重复例数为3。6、细胞侵袭实验检测下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞侵袭能力的影响取对数生长期的细胞,用无血清RPMI1640培养过夜。通过24孔趋化小室和matrigel胶检测细胞侵袭性。结果表示为同时穿过matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数,显微镜下随机取5个视野计数。实验分为CNE-2组,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组,每组重复例数为15。7、异质粘附实验检测下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞异质粘附能力的影响以Matrigel胶模仿基底膜进行异质粘附实验,Matrigel胶4℃过夜融化,取96孔板,Matrigel胶50μL/孔铺板,轻轻摇晃铺平Marigel胶,37℃1Omin凝固。10g/L BSA (1×PBS配制)煮沸13min变性后,每孔加100μL,37℃封闭1h,封闭结束后用1×PBS冲洗2次。待测细胞培养至对数生长期,用无血清RPMI1640培养过夜。收集细胞,调整细胞数为5×104/孔,加入细胞悬液,5%CO2 37℃孵育1h。取出96孔板,1×PBS冲洗,每孔加入100μL RPMI1640和10μLCCK-8,37℃、5%CO2培养1h,测量两组OD450nm值。96孔板直接铺10g/L BSA,不铺Matrigel胶为对照组。粘附率=(实验组OD450nm/对照组OD450nm-1)%。实验分为CNE-2组,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组,实验重复例数为16。8、平板克隆形成实验观察下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞放射敏感性的影响取对数生长期的待测细胞倍比稀释,每个六孔板接种200个细胞,24小时细胞贴壁后接受X线照射(0,2,4,6,8Gy)。2周后计算形成的克隆数,通过克隆数计算出细胞生存分数。实验分为CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组,每组重复例数为16。9、平行板流动腔检测下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2与血管内皮细胞粘附能力的影响流动腔的下表面为35mm的培养皿,上表面为聚甲基丙烯酸甲酯制成的平板,上下表面之间用0.2mm的硅胶垫隔开,形成一个20mm×2.5mm×0.2mm的腔。流动腔还有一个进口和出口,进口连接的是装着细胞的离心管,出口连接着一个输液器泵,能维持稳定的流体剪切力。待测血管内皮细胞培养至对数生长期,用0.25%胰酶消化细胞,离心,重悬,接种于直径为35mm的培养皿。待细胞铺满80%-90%进行实验。用2%的BSA封闭血管内皮细胞4小时,取对数生长期的CNE-2 GnT-V/NC细胞和CNE-2 GnT-V/2224细胞,消化、重悬,调整细胞的浓度为106/ml。在0.25 dyn/cm2的流体剪切力下,肿瘤细胞通过流动腔。5分钟后记录实验结果。随机挑选5个视野,计算和血管内皮细胞粘附的肿瘤细胞的数量。每组重复例数为15。9、检测沉默GnT-V表达后对CNE-2凋亡和周期的影响细胞培养至对数生长期后,常规胰酶消化,收集细胞。进行石蜡包埋。按试剂盒说明进行TUNEL实验,检测细胞的凋亡。呈棕色的为凋亡细胞,随机挑选5个视野计算细胞凋亡率。每组重复例数为3。细胞培养至对数生长期后,常规胰酶消化,用PBS洗涤细胞2次,收集105细胞。在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液,混匀。收集细胞中加入上述7-AAD染液,混匀；室温、避光、反应5～15min。反应后再加入450μL的Binding Buffer混匀。加入1μLAnnexin V-PE混匀；室温、避光、反应10min。用流式细胞仪检测细胞凋亡。每组重复例数为3。细胞培养至对数生长期后,常规胰酶消化,PBS洗3次,制成单细胞悬液,并调整细胞浓度至106/ml。加入3ml预冷PBS重悬细胞,800rpm×5min,吸净上清。.加入500ul PBS,轻轻重悬细胞,使细胞分离为单个,加入预冷的75%乙醇(-20℃)。.取出固定的样品,800 rpm×5min,弃上清。加入3 ml预冷PBS重悬细胞和PI工作液,4℃避光染色30分钟。转至流式检测管,上机检测细胞周期。每组重复例数为3。10、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。qRT-PCR、Western-Blot.侵袭实验、异质粘附实验结果多组比较采用完全随机设计的方差分析,多重比较采用LSD法。平行板流动腔实验、细胞周期和凋亡实验采用两独立样本t检验,参数比较均先进行方差齐性检验,若方差不齐,用基于方差不齐的近似F检验(Welch法)。细胞增殖实验、细胞划痕实验、平板克隆实验采用析因设计的方差分析。由于方差不齐,所以细胞增殖实验每组细胞内5个时间点的多重比较采用Dunnett’sT3法；由于方差齐性,所以细胞划痕实验每组细胞内3个时间点的多重比较和平板克隆形成实验每组细胞内多个剂量的多重比较均采用LSD法。P<0.05代表有统计学差异。四、结果1、重组质粒的稳定转染质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因,故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下观察,细胞均发荧光,说明稳定转染成功。2、干扰效果分析通过qRT-PCR实验检测CNE-2,CNE-2 GnT-V/NC,CNE-2 GnT-V/1564和CNE-2 GnT-V/2224四组细胞株中GnT-VmRNA的表达量。CNE-2 GnT-V/1564的2-ΔΔCt值为(0.43±0.06),CNE-2 GnT-V/2224的2-ΔΔCt值为(0.33±0.03),表明CNE-2 GnT-V/2224中GnT-V mRNA的表达量较CNE-2GnT-V/1564少。Western blot结果也显示CNE-2 GnT-V/2224中蛋白的表达量较CNE-2 GnT-V／1564少。选择干扰效率较高的CNE-2 GnT-V/2224进行下一步实验。CNE-2 GnT-V/NC中GnT-VmRNA和蛋白的差异均无统计学意义。3.GnT-V shRNA对细胞增殖的影响通过Cck-8法检测CNE-2,CNE-2 GnT-V/NC和CNE-2 GnT-V/2224三组细胞的增殖能力。以细胞在不同时间点(0h、24h、48h、72h、96h)的生长分数值绘制细胞生长曲线,并计算出CNE-2 GnT-V/2224的生长分数。可见CNE-2 GnT-V/2224的生长分数较CNE-2 GnT-V/NC低(P<0.001)。说明下调GnT-V的表达后,细胞的增殖能力明显降低。4.GnT-V shRNA对细胞迁移能力的影响下调GnT-V的表达延长了细胞划痕愈合时间,说明下调GnT-V的表达后抑制了细胞的迁移能力。5.GnT-V shRNA对细胞侵袭能力的影响CNE-2 GnT-V/2224组和CNE-2GnT-V/NC组穿过Matrigel胶和聚碳酸酯膜的细胞数分别为(58.20±8.53)个和(127.47±9.22)个(t=21.361,P<0.001)。实验结果显示,下调GnT-V表达可以抑制CNE-2细胞的侵袭能力。6.GnT-V shRNA对CNE-2细胞异质粘附能力的影响CNE-2 GnT-V/2224组和CNE-2GnT-V/NC组的粘附率分别为(35.70±28.27)%和(70.10±14.82)%,说明下调GnT-V表达,可抑制CNE-2细胞的异质粘附能力。7.GnT-V shRNA对CNE-2与血管内皮细胞粘附能力的影响粘附于血管内皮细胞的CNE-2 GnT-V/NC和CNE-2GnT-V/2224的细胞数分别为(240.80±29.50)和(57.60±12.85),两者间有统计学差异。表明下调GnT-V的表达抑制鼻咽癌细胞对血管内皮细胞的粘附能力。8.GnT-V shRNA对CNE-2放射敏感性的影响CNE-2 GnT-V/2224组的生存分数较CNE-2GnT-V/NC组低,且放射增敏比为1.37,说明下调GnT-V的表达后细胞的放射敏感性增高。9.GnT-V shRNA对CNE-2细胞周期和凋亡的影响利用TUNEL实验计算出CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC的细胞凋亡率分别为(35.31±2.61)%和(18.97±1.64)%。通过流式细胞仪得出CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC的细胞凋亡率分别为(26.11±2.43)%和(10.80±1.90)％.CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC S期比例的细胞分别为(28.40±0.27)%和(41.60±1.74)％。CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC G1期比例分别为(59.93±2.38)%和(43.43±2.90)%。下调GnT-V的表达后细胞的凋亡率增加,细胞周期从G1期到S期发生阻滞。10.Western blot的实验结果表明CNE-2 GnT-V/2224中bcl-2蛋白的表达量较CNE-2 GnT-V/NC降低(53.00±3.61)%。且CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC两组细胞经照射后再次检测bcl-2蛋白的表达,发现：经过照射后CNE-2 GnT-V/2224中bcl-2蛋白的表达量较放射前降低了(25.33±9.07)%,而CNE-2 GnT-V/NC组中bcl-2蛋白相对于GAPDH的光密度值在放射前后分别为(80.67±2.52)%和(75.67±6.03)%,但差异无统计学意义(t=1.326,P=0.256)。CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC两组细胞中E钙粘蛋白表达量的差异无统计学意义。说明下调GnT-V的表达对E钙粘蛋白的表达量无影响。五、结论1、靶向GnT-V的shRNA真核表达质粒可以下调GnT-V的mRNA和蛋白表达。2、下调GnT-V表达后,CNE-2细胞的体外增殖、迁移、侵袭能力受到抑制,细胞凋亡率增加,细胞周期发生阻滞。3、下调GnT-V表达后细胞的放射敏感性增高,可能与bcl-2蛋白的改变有关。4、下调GnT-V表达对E钙粘蛋白的表达量无影响。