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目的 血管平滑肌细胞(VSMC)是血管壁的主要组成部分。已证实，VSMC的异常增殖是动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等的主要病理基础，在血管内膜增生及血管重塑中起重要作用。因而抑制VSMC过度增殖，对预防和治疗术后再狭窄有重要意义。 1998年2月Fire和Mello首次在《Nature》杂志上发表了把双链RNA(dsRNA)注射入一种线虫(Caenorhabditis elegans)内，结果dsRNA诱导了基因靶向专一性的转录后基因沉默(PTGS)，他们将这种现象称为RNA干扰(RNAi)。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，其机制正在逐步阐明，RNAi不但是基因功能研究的一种有力工具，还为基因治疗提供了新的治疗手段。近几年来国际上RNAi的研究取得了很大进展，已在小鼠和人等哺乳动物的体外培养细胞中利用RNAi技术成功阻断了特异基因的表达，这为人类治疗某种基因过度表达或某种突变基因表达引起的疾病提供了一种新方法。 肾素—血管紧张素系统(RAS)不仅在调节血压、维持水电解质平衡等方面起重要作用，近来研究表明血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是肾素血管紧张素系统的关键效应分子，对血管平滑肌细胞、心肌细胞及成纤维细胞具有生长激素样作用，可能参与了阻塞性血管疾病如冠心病、血管成形术后再狭窄的发生。其中Ang Ⅱ绝大部分功能由血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)介导，Ang Ⅱ与血管紧张素Ⅱ1型受体(A71R)结合刺激VSMC肥大和增殖，导致血管壁增厚及管腔缩小，在血管重构中占重要地位。为此我们构建了鼠AT1R短发夹环RNA(shRNA)质粒，并进行鉴定；并验证其是否具有RNAi作用；转染VSMC观察大鼠血管平滑肌细胞增殖的变化并探讨其可能机制。 方法 实验一、鼠血管紧张素Ⅱ1型受体短发夹环RNA质粒的构建与鉴定 在GeneBank中查到大鼠血管紧张素Ⅱ的1型受体mRNA基因序列(登录号NM夕31009)并输人到RNAi设计软件中，以此设计引物序列。以U6启动子质粒为模板，共同PCR扩增U6启动子;将纯化的PCR产物通过xh。I和BalnHI位点酶切、回收，经T4连接酶连接插人pGEM@一T载体;转化至感受态的DH5a菌种中，氨节青霉素筛选，挑取阳性克隆，摇菌，小提质粒;酶切鉴定测序，确认得到的克隆的序列正确，分别命名为pATIR-shRNA，和pATIR一shRNAZ。取酶切鉴定正确的1以菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 实验二、血管紧张素nl型受体短发夹环RNA抑制其在大鼠血管平滑肌细胞中的表达 应用构建的质粒pATIR一shRNA转染人鼠血管平滑肌细胞中，24h后应用RT一PCR及Westem blot方法检测血管平滑肌细胞ATIR的mRNA和蛋白表达的变化。 实验三、血管紧张素nl型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 应用构建的质粒pATIR一shRNA转染入鼠血管平滑肌细胞中，24h后应用RT一PCR及Westem blot检测血管平滑肌细胞ATIR的mRNA和蛋白表达的变化及A几R的mRNA的变化;倒置相差显微镜观察VSMC形态学的变化;台盼蓝染色法和M竹法检测VSMC增殖的变化等。结果 实验一、鼠血管紧张素nl型受体短发夹环RNA质粒的构建与鉴定 PCR产物为”U6启动子一shRNA”长度为412bp，获得了与预期相符的扩增片段，经测序鉴定结果完全正确。构建的质粒pATIR一shRNA经酶切、测序鉴定验证，确认得到的序列正确。 实验二、血管紧张素nl型受体短发夹环RNA抑制其在大鼠血管平滑肌细胞中的表达 转染细胞后ATIR的RT一PCR吸光度值比值结果pATIR一shRNA:和PATIR一shRNAZ组分别为1 .371士0.148和1 .453士0.123，与对照组2.088士0.258相比差异有显著性(P<0.01);Westem blot吸光度值比值结果两质粒转染组分别为1 .121士0.037和1 .202土0.068，与对照组3.168土0.21相比差异有显著性(P<0.01)。提示两质粒均能明显降低ATIR的mRNA和蛋白表达。 实验三、血管紧张素111型受体短发夹环RNA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 转染细胞后ATIR的RT一PCR吸光度值比值结果pATIR一shRNAI和pATIR一shRNAZ组分别为1 .371土0.148和1.453士0.123，与对照组2.088土0.258相比差异有显著性(P<0.01);Westem blot吸光度值比值结果两质粒转染组分别为1 .121士0.037和1 .202士0.068，与对照组3，168土0.21相比差异有显著性(P<0.01)，提示两质粒均能明显降低ATIR的mRNA和蛋白表达。转染细胞后两质粒转染加Angn组的A犯R mRNA表达明显增加，分别为0.378*0.029和0.344土0.045;与正常对照组0.25土0.022、Angn对照组0.238土0.023相比均有显著性差异(P<0.01)。细胞计数结果转染质粒同时加Angn组分别为5 .483士0.436和5.55士0.446，与对照组8.133士0.408相比均减少、差异有显著性(P<0.01)，MTI’法结果两质粒转染组吸光度值分别为0 .365土0.024和0.307士0.025，与对照组0.485土0.011相比均降低、差异有显著性(P<0.01)，提示两质粒均能明显抑制VSMC增殖，与VsMC形态学检测结果相符。结论 1.构建血管紧张素111型受体短发夹环RNA质粒成功，两个质粒pATIR一shRNA均明显抑制VSMC的ATIR的mRNA和蛋白表达，具RNAi作用; 2.质粒pATIR一shRNA通过RNAi的作用抑制ATI R mRNA翻译，从而抑制ATIR?