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大豆(Glycine max(L.)Merrill)是人类饮食和畜禽饲养最重要的植物蛋白来源之一。利用生物工程手段改良蛋白品质即提高食用大豆含硫氨基酸的含量,有效的措施之一就是对涉及硫同化路径中的酶进行遗传操作,但首要条件是必须了解含硫氨基酸生物合成的分子机制.本研究在于对催化半胱氨酸合成的关键步骤反应的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶(OAS-TL)开展基因克隆和功能分析。首先,比较了大豆属两个大豆种野生大豆(Glycine soja Sleb.et Zucc.)和栽培大豆(Glycine max(L.)Merrill)OAS-TL催化的半胱氨酸合成的分子机制,表明OAS-TL相关的研究既有保守性又有特异性.保守性在于:从两个野生大豆(ZYD4174和ZYD3564)和两个栽培大豆(NN99-10和963069)中克隆了一个大豆OAS-TL基因的cDNA,在核苷酸和氨基酸水平上不同来源的OAS-TL序列均非常保守;从野生大豆ZYD4174中克隆了其基因组序列,其含有10个外显子和9个内含子;发现野生和栽培大豆成熟种子中含硫氨基酸含量在不同物种间没有显著差异.特异性在于:用于上述克隆的4份材料R3时期种子中的总OAS-TL活性为野生材料高于栽培材料;对于不同器官,野生材料ZYD4174中OAS-TL在根和种子里的表达量较其它器官较低,但种子中的酶活性显著高于其它器官,而在栽培材料NN99-10中,OAS-TL在茎、叶片和种子中表达量较高,但发现在根和种子中酶活性较高;对从野生大豆ZYD4174和栽培大豆NN99-10克隆出的OAS-TL cDNA进行体外表达,发现两种来源cDNA都能表达出目的蛋白条带,但仅有从ZYD4174克隆的cDNA表达产物用xys~-营养缺陷型菌NK3验证具有活性,据其编码序列创造3个片段缺失体,结果表明其均不能像全长cDNA一样表达具有催化活性的蛋白。其次,利用生物信息学检索、RT-PCR和3’RACE-PCR反应相结合,从栽培大豆NN99-10中克隆了6个新的OAS-TL基因的全长cDNA。将6个OAS-TL序列递交到GenBank中进行同源性搜索,发现各OAS-TL推导蛋白与已登录序列的比较结果为:GmOAS-TL1与西瓜OAS-TL一致性达89%,GmOAS-TL2与已报道的大豆OAS-TL一致性达89%,GmOAS-TL3与苹果CAS蛋白的一致性达84%,GmOAS-TIA与烟草质体型CSase达86%的一致性。GmOAS-TL6和GmOAS-TL7均与拟南芥CSase达73%的一致性。系统发育分析表明,GmOAS-TL3和GmOAS-TL4分别被划分为CAS类似类型和质体定位类型,而其它4个OAS-TL被划分为细胞质定位类型。进一步对GmOAS-TL2、GmOAS-TL3和GmOAS-TL4的基因组DNA进行了比较分析。在编码区域,GmOAS-TL3和GmOAS-TL4都有10个外显子和9个内含子,每个外显子长度和内含子插入位置高度保守.GmOAS-TL2也有这些基本相似的基因组结构,但它比前两者多一个6 bp的短外显子。除了GmOAS-TL2的短外显子前后的两内含子外,其它内含子都一致性地符合GT-AG剪切规则.Southern杂交显示,GmOAS-TL3在大豆基因组中可能存在1-2个拷贝,且有少量同源基因存在,GmOAS-TL4基因可能存在1个拷贝和1个同源基因.再次,对克隆的OAS-TL基因进行了原核表达和器官表达分析.对6个OAS-TL基因进行原核表达,重组蛋白活性测定及用cys~-营养缺陷型NK3菌验证的结果一致表明,除GmOAS-TL2和GmOAS-TL7之外,其它4个OAS-TL基因均能表达出有催化活性的蛋白;对OAS-TL基因进行RT-PCR分析,发现在野生大豆ZYD4174和栽培大豆NN99-10不同器官中,GmOAS-TL4和GmOAS-TL7都为组成性表达,且在NN99-10中两者都在叶片中表达量较高;GmOAS-TL、GmOAS-TL1和GmOAS-TL3表现出部分程度上的相似性,在ZYD4174器官样品中,三者均在种子中检测不到表达,而在NN99-10中,3个基因几乎都在荚皮中检测不到表达,但在种子中的表达量相对较高;GmOAS-TL2和GmOAS-TL6表现为特异性表达,GmOAS-TL2仅在ZYD4174的花和NN99-10的种子中明显检测到表达,GmOAS-TL6则仅在NN99-10的叶片中检测到较高的表达量;对NN99-10的四轮花器官进行表达检测,发现GmOAS-TL2在雌蕊中检测量最高,而GmOAS-TL6仅在花瓣中检测到较高的表达量.各OAS-TL基因的表达特性可能与其参与不同器官或特定环境条件下的半胱氨酸合成作用有关.在种子发育进程不同时期中,除了GmOAS-TL3以外大豆OAS-TL基因mRNA的积累几乎都从种子发育早期到中期逐步增加,而在后期明显下降,这在整体程度上与种子OAS-TL活性呈现出一致性,表明这些OAS-TL基因在种子发育进程中起着协同表达的作用。在种子整个籽粒发育阶段中种子中半胱氨酸含量与OAS-TL活性呈现显著负相关,可能表明大豆半胱氨酸合成在整体上受到相关调节因子的调控或平衡.此外,将GmOAS-TL4用洋葱表皮细胞进行亚细胞定位研究,结果表明GmOAS-TL4很可能定位于质体中。构建了置于种子贮藏蛋白a亚基基因启动子下的植物转化载体pBI121-aP-GFP::OAS4F1,为转化大豆提高种子含硫氨基酸含量奠定了基础。