隔日限食疗法对大鼠急性脊髓损伤后神经保护作用的机制研究

来源 :成都中医药大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:jiba00
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目的:观察隔日限食疗法(every-other-day fasting, EODF)对大鼠急性脊髓损伤(acute spinal cord injury,ASCI)后运动功能、脊髓神经细胞凋亡、炎性因子及血清炎性因子的影响,了解神经细胞凋亡、炎性反应和运动功能恢复之间的关系,从抗凋亡、抗炎方面初步探讨EODF对ASCI的神经保护作用及其可能机制。为EODF用于临床治疗ASCI提供实验依据。方法:将48只雌性成年Wistar大鼠,随机分成EODF组(A组,n=16)、正常饮食对照组(B组,n=16)、假手术组(C组,n=16)。采用改良Aleln’s打击法建立Wistar大鼠胸段脊髓损伤模型。A组于术后立即给予EODF, B组及C组给予正常饮食。各组大鼠分别于术后6h、1d、3d、7d行动物行为学BBB评分(Basso Beattie and Bresnahan scores, BBB scores)观察大鼠运动功能变化后处死,取损伤段脊髓组织行石蜡切片后,通过苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色来观察脊髓组织结构变化,并通过免疫组化检测(SP法)观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达情况,观察炎性因子白介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白介素-10(Interleukin-10, IL-10)的表达情况;运用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-6、IL-10的含量。结果:1.行为学观察结果:脊髓损伤后6h,A、B两组均表现出双后肢瘫痪的严重运动功能障碍,BBB评分均为0.00±0.00,与C组比较,差异有统计学意义(P<0.01);随时间延长,A、B两组BBB评分均呈上升趋势,在脊髓损伤3d后,A、B两组比较,差异有统计学意义(P<0.01),A组出现后肢三个关节(髋、膝、踝关节)的轻微活动,BBB评分为4.00±0.82,而B组仅出现髋、膝一到两个关节的轻微活动,评分为1.75±0.50;至脊髓损伤7d后,A、B两组差异有统计学意义(P<0.01),A组可见足底负重位及足背负重步行,BBB评分为9.00±0.82,而B组仅见两个关节轻微活动及一个关节的较大幅度活动,BBB评分为5.50±1.29。2.HE染色结果:A、B两组经造模后脊髓组织均可见不同程度的出血灶、炎性细胞浸润以及空洞形成,可见明显的神经细胞变性,灰白质界限欠清;较之于B组,A组经EODF干预后病理学改变可见改善;C组脊髓结构规则,灰白质界限分明,白质致密,无明显出血、水肿、炎细胞浸润。3.免疫组化结果:(1) Caspase-3、Bax:脊髓损伤6h后,与C组比较,A、B两组Caspase-3表达(分别为34.67±0.98,35.94±3.17)及Bax表达(分别为39.09±0.82,40.16±1.09)均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);随时间延长,A、B两组Caspase-3及Bax表达均呈先升后降趋势,峰值均出现在1d,在脊髓损伤3d后,A组Caspase-3、Bax表达均值(26.87±0.77,37.93±0.84)小于B组(31.47±1.56,39.69±0.88),差异有统计学意义(P<0.01);至脊髓损伤7d后,A组Caspase-3、Bax表达均值(21.75±0.99,31.36±1.90)明显小于B组(31.43±2.09,39.01±1.65),差异有统计学意义(P<0.01)。提示EODF可减少脊髓组织中Caspase-3、Bax的表达。(2)Bcl-2:与C组比较,脊髓损伤6h后,A、B两组Bcl-2表达(分别为12.05±1.12,10.78±0.72)均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);随时间延长,A、B两组Bel-2表达均呈先升后降趋势,峰值出现在3d,在脊髓损伤1d、3d、7d后,A组Bcl-2表达均值(27.25±0.85,37.11±0.57,31.53±0.82)均大于B组(20.41±0.75,25.23±0.71,22.23±0.97),差异有统计学意义(P<0.01)。提示EODF可增加脊髓组织中Bcl-2的表达。(3)IL-6:脊髓损伤6h后,A、B两组IL-6表达(分别为31.30±2.57,31.64±1.73)与C组比较均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);随时间延长,A组IL-6表达呈先升后降趋势,峰值在1d,B组IL-6表达呈上升趋势,在脊髓损伤3d、7d后,A组IL-6表达均值(28.41±1.68,27.09±1.34)小于B组(34.64±2.69,35.16±2.75),差异有统计学意义(P<0.01)。提示EODF可减少脊髓组织中IL-6的表达。(4)IL-10:与C组比较,脊髓损伤6h后,A、B两组IL-10表达(分别为15.98±0.88,15.60±1.33)均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01):随时间延长,A、B两组IL-10表达均呈上升趋势,在脊髓损伤1d后,A组IL-10表达均值(17.62±0.85)大于B组(16.39±1.38),差异有统计学意义(P<0.05);至脊髓损伤3d、7d后,A组IL-10表达均值(20.47±1.87,16.75±1.70)大于B组(23.51±1.85,17.13±1.22),差异有统计学意义(P<0.01)。提示EODF可增加脊髓组织中IL-10的表达。4血清IL-6、IL-10含量的ELISA结果:(1)IL-6:脊髓损伤6h后,A、B两组血清IL-6含量(分别为87.07±3.72,87.77±4.41)与C组比较均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);随时间延长,A、B两组血清IL-6含量呈先升后降趋势,A组峰值在1d,B组峰值在3d,在脊髓损伤3d、7d后,A组血清IL-6含量均值(101.56±8.55,51.42±6.29)小于B组(121.79±4.69,108.24±4.56),差异有统计学意义(P<0.01)。提示EODF可减少血清IL-6的产生。(2)IL-10:脊髓损伤6h后,A、B两组血清IL-10含量(分别为21.83±0.27,21.71±0.64)与C组比较均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);随时间延长,A、B两组血清IL-10含量均呈上升趋势,在脊髓损伤3d、7d后,A组血清IL-10含量均值(29.11±0.54,34.41±0.57)小于B组(25.76±0.64,26.12±1.61),差异有统计学意义(P<0.01)。提示EODF可减少血清IL-10的产生。5. EODF组相关性分析结果:Caspase-3、Bax、脊髓IL-6阳性细胞表达及血清IL-6与BBB评分之间均呈负相关(r=-0.756、-0.730、-0.774、-0.734,P<0.01);Bcl-2、脊髓IL-10阳性细胞表达及血清IL-10与BBB评分之间均呈正相关(r=0.899、0.933、0.951,P<0.01);脊髓IL-6阳性细胞表达与血清IL-6含量之间呈正相关(r=0.636,P<0.01);脊髓组织IL-10阳性细胞表达与血清IL-10含量之间呈正相关(r=0.882,P<0.01)。结论:1. EODF可改善ASCI大鼠后肢运动功能,提示其对SCI具有治疗作用;2. EODF能够减轻ASCI后神经细胞凋亡及炎性反应,具有神经保护作用,其作用机制可能与抑制促凋亡因子Caspase-3、Bax的表达及促炎性因子IL-6的产生,增加抗凋亡因子Bcl-2的表达及抗炎因子IL-10的产生来抑制细胞凋亡及炎性反应,减轻继发性损伤,促进功能恢复有关。
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