胃肠道长期暴露于大量外来抗原刺激,包括共生菌、致病菌、肠道内容物,宿主通过多种途径维持肠道的免疫稳态。肠道粘膜是辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)分化成熟的天然场所,Thl7可分泌白细胞介素17A(Interleukin17A,IL-17A),白细胞介素17F (Interleukinl 7F, IL-17F),白细胞介素21(Interleukin21,IL-21),白细胞介素22 (Interleukin22, IL-22). IL-17作为Th17的代表细胞因子,能刺激肠道上皮细胞分泌抗菌肽。研究还发现胃肠道和肺中的Th17可以诱导粘膜免疫球蛋白(immunoglobulin A, IgA)。IL-17A和IgA可以协助维持肠道稳态。尽管Thl7在不同的实验模型中表现出促进炎症或抑制炎症的作用,已有研究表明这些细胞在肠道粘膜稳态中起到重要作用,尤其是在含有大量共生菌群时。但能够促进肠道Th17的分化成熟的细胞和环境因素仍需要进一步的研究。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)在大肠和小肠固有层广泛分布,形成紧密的网络,可以调节肠道对共生菌产生的固有免疫和适应性免疫应答。树突状细胞通过表达归巢受体α4β7和CCR9指导淋巴细胞归巢,使其再循环至肠道。因此,树突状细胞在控制肠道炎症及维持免疫稳态中起到重要作用。肠道固有层存在多种亚型的树突状细胞,根据来源不同及表型,通常将其分CD11c+CD11b+CD8α-树突状细胞即髓系树突状细胞(myloid DC, mDC), CD11c+CD11b-CD8a+树突状细胞即淋巴系树突状细胞(lymphoid DC, IDC), CD11c+CD11b-B220+树突状细胞即浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid DC,pDC)。小肠中部分树突状细胞表达CX3CR1, CX3CR1+DC通过上皮间树突状细胞对肠内容物检测取样从而决定微生物的摄取,进而“守卫”胃肠道粘膜屏障。近期研究表明一些亚型的肠道固有层树突状细胞表达CD103,而CD103+和CD103-肠道固有层树突状细胞在介导B淋巴细胞分泌IgA及肠道营养T淋巴细胞起到不同的作用,即调节T淋巴细胞和B淋巴细胞反应。根据CD103和CDllb的表达将肠道树突状细胞分为四群,但不同亚群的树突状细胞在肠内微生物抗原摄取、递呈中的作用仍不明了。另外这四种不同的树突状细胞对肠道微生物免疫应答的机制到底是协同合作还是各有分工;如何调节适应性免疫,怎样诱导不同的T淋巴细胞分化发育仍有待进一步研究。一系列研究显示DCs对不同微生物刺激的应答表现出明显的灵活性或“可塑性”,但更多的证据表明不同亚型的DC在抗原递呈、刺激不同类型免疫应答的能力上存在本质的差异。研究发现多种不同亚型的树突状细胞表达不同的Toll样受体(TLRs),对微生物刺激的反应也不同。比如,CD8α-树突状细胞有较强的吞噬能力,CD8a+树突状细胞可以内化凋亡细胞。只有髓系树突状细胞(mDC)可以识别TLR3,4,7,9,并释放IL-23,IL-12。浆细胞样树突状细胞同样可以分泌IL-12,但却不能识别TLR3,4,7,9。表达TLR5的CD103+CD11b+树突状细胞通过激活TLR5信号通路识别鞭毛激发固有免疫应答,释放IL-6促进肠内Th17分化,因此推测肠道固有层树突状细胞可以诱导Th17分化可能与TLR5相关。信号调节蛋白α(Signal regulatory protein alpha, SIRPα/CD172a)是一种保守型跨膜蛋白。CD172α阳性肠道固有层树突状细胞能促进Th17成熟分化。TLR5是否介导CD172α阳性肠道固有层树突状细胞识别共生菌、激发免疫应答、诱导Th17分化,从而控制免疫稳态及肠道炎症需要进一步研究。基于以上理论和研究,本文分两个部分对以上问题进行探讨：1、肠系膜淋巴结与肠固有层树突状细胞TLR5和CD172α表达量不同诱导不同T细胞免疫应答；2、TLR5介导CD 172 α+肠道固有层树突状细胞诱导微生物抗原特异性Th17成熟分化。研究内容：第一部分：1.自CBirl转基因小鼠体内分离脾CD4阳性T淋巴细胞本研究中依据Cao等人提取脾CD4阳性T淋巴细胞经典方法,利用CD4特异性的显微磁珠,对脾内淋巴细胞进行阳性分选,流式细胞术分析CD4阳性细胞率约为75%-80%。2.CBir1鞭毛蛋白刺激体内脾T淋巴细胞产生Thl型免疫反应为了研究T细胞对菌群的反应,将羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE)标记的CBirl特异性CD4阳性T淋巴细胞通过尾静脉注射过继回输到T淋巴细胞受体p链和δ链敲除(TCRβ×δ-/-)小鼠体内。TCRβ×δ-/-小鼠因肠道IgA绝对减少,CBirl特异性CD4阳性T淋巴细胞可以穿过上皮层。给受体小鼠灌胃重组的CBirl鞭毛蛋白,三天后处死,分离脾淋巴细胞,流式检测细胞内因子干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)和IL-17A的阳性细胞数,发现脾内的CBirl转基因T细胞只分泌IFN-γ,不分泌IL-17A。3.CBir1鞭毛蛋白刺激体内肠固有层内T淋巴细胞既可以产生Th1型免疫反应,也可以产生Th17型免疫反应。将CFSE标记的CBirl特应性的T淋巴细胞过继回输到TCRβ×6基因敲除小鼠体内,同时灌胃CBirl鞭毛蛋白。本研究中依据Cong等人提取肠道固有层淋巴细胞的经典方法,利用胶原酶消化,梯度离心,得到肠道固有层淋巴细胞,再用PMA和Ionomycin刺激5小时,与Pacific Blue结合的CD4阳性的流式抗体标记、分选出CD4阳性的T淋巴细胞,检测其IFN-γ和IL-17A的表达,结果发现肠道固有层CBirl转基因T细胞既分泌IFN-γ也分泌IL-17A。4.分离提取脾、肠道固有层树突状细胞利用autoMAC磁性分选仪及CDllc抗体标记的显微磁珠对脾、肠道固有层淋巴细胞进行阳性分选,流式细胞术检测CD11c阳性率约为75%。5.CBirl鞭毛蛋白刺激脾树突状细胞体外诱导CBirl特异性T细胞分化为Thl已有研究报道树突状细胞可以指导T细胞发育为不同亚型,所以进一步研究是否因为脾内树突状细胞和肠道固有层树突状细胞的不同导致Thl和Thl7分化结果不同。将CBirl特异性T细胞与脾树突状细胞共培养,给予有TLR5活性的全长CBirl鞭毛蛋白或无TLR5活性的CBirl多肽,用流式细胞术检测FN-γ和IL-17A的表达。给予CBirl多肽和CBirl鞭毛蛋白处理T细胞都分泌大量的IFN-γ。6.CBir1鞭毛蛋白刺激肠道固有层树突状细胞体外诱导CBirl特异性T细胞分化为Th1和Th17将CBir1特异性T细胞与脾树突状细胞共培养,给予有TLR5活性的全长CBirl鞭毛蛋白或无TLR5活性的CBir1多肽,用流式细胞术检测发现给予CBir1多肽的处理组,与肠道固有层树突状细胞共培养,CBir1特异性T细胞只产生IFN-γ而不产生IL-17A；给予全长CBir1鞭毛蛋白的处理组,与肠道固有层树突状细胞共培养的CBir1特异性T细胞即表达IFN-γ也表达IL-17A。7.肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)树突状细胞和肠固有层树突状细胞具有摄取CBirl鞭毛蛋白的能力为检测MLN树突状细胞和肠道固有层树突状细胞是否可以摄取粘膜表面的CBir1鞭毛蛋白,给予正常野生型小鼠或TCRβ×δ-/-小鼠Alexa 647标记CBir1鞭毛蛋白灌胃处理。(Alex 647标记CBirl鞭毛蛋白与不标记的CBirl鞭毛蛋白刺激CBir1特异性T细胞增殖的能力相同,而且细胞因子的表达也没有差异。)2小时后,提取MLN树突状细胞和肠道固有层树突状细胞,流式分析CBirl鞭毛蛋白的摄取量.TCRβ×δ-/-小鼠体内MLN树突状细胞和肠道固有层树突状细胞都是Alexa 647阳性的,而正常野生型的为阴性。8.肠系膜淋巴结(Mesenteric lymph nodes,MLN)树突状细胞和肠固有层树突状细胞具有摄取CBir1鞭毛蛋白并刺激T淋巴细胞免疫能力分别从CBir1转基因小鼠和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)特异性TCR转基因小鼠(OT-II小鼠)体内分离提取CBir1特异性T细胞和OVA特异性T细胞,与TCRβ×δ-/-小鼠体内提取的携带CBirl鞭毛蛋白的肠道固有层树突状细胞共同培养,检测T细胞增殖。肠道固有层树突状细胞可以刺激CBir1特异性T淋巴细胞增殖,不能刺激OVA特异性T细胞增殖。CBir1鞭毛蛋白灌胃处理的野生型小鼠的肠道固有层树突状细胞不能刺激CBir1特异性T增殖；PBS灌胃的TCRβ×δ-/-小鼠的肠道固有层树突状细胞可以刺激CBir1特异性T细胞增殖,但增殖水平较低。第二部分：1.脾、肠道固有层树突状细胞TLR5和CD172a的表达不同亚型的树突状细胞存在于不同组织中,已有研究确定肠道固有层内存在髓系树突状细胞(表型为CD11c+CD11b+CD8α-),淋巴系树突状细胞(表型为CD11+c+CD11b-CD8a+),浆细胞样树突状细胞(表型为CD11c+CD11b-B220+)。树突状细胞可以表达多种Toll样受体,所以我们利用流式检测TLR5和CD172 a在脾和肠道固有层各种亚型(CD103+, CD103-, CD11b+,CD11b-)树突状细胞的表达。过去有研究认为,与脾树突状细胞相比,多数CD11c阳性肠道固有层DC表达TLR5。本文研究结果表明CD11c+CD11b+和CD11c+CD11b-树突状细胞都表达TLR5,但是在双阳性的CD11c+CD11b+肠道固有层树突状细胞中TLR5表达量比单阳性C D11c+CDllb-肠道固有层树突状细胞高。这些结果与之前用Alexa标记的CBir1鞭毛蛋白作为TLR5的受体确定了TLR5不是CBir1鞭毛菌的特异性受体的结果相吻合。2.脾树突状细胞受LPS刺激激活免疫反应；肠道固有层树突状细胞受CBir1鞭毛蛋白刺激激活免疫反应。为检测脾树突状细胞和固有层树突状细胞不同的TLR5的表达量是否影响他们对CBir1鞭毛菌刺激的免疫应答,分别用全长的CBir1鞭毛蛋白或带有鞭毛的可以产生CBir1鞭毛蛋白的A4菌处理C57BL/6小鼠的脾树突状细胞或肠道固有层树突状细胞。曾经研究表明肠固有层树突状细胞TLR4的表达量远远低于脾树突状细胞,所以用脂多糖(lipopolysacchirde, LPS)刺激肠道固有层树突状细胞和脾树突状细胞作为对照。用酶联免疫吸附实验(ELISA)测量细胞培养24小时后上清液中的细胞因子表达。脂多糖刺激脾树突状细胞释放大量IL-12p70和IL-6,少量IL-23；而在CBir1鞭毛蛋白和带鞭毛的A4菌刺激后释放更少的IL-12p70和IL-6,相比之下,肠道固有层树突状细胞对LPS刺激几乎没有免疫反应,但在CBir1鞭毛蛋白和带鞭毛的A4菌刺激下会释放大量IL-12p70, IL-23, IL-6。3.TGF-β抗体抑制肠固有层树突状细胞诱导Th17极化为探究在CBir1鞭毛蛋白递呈过程中不同的脾树突状细胞和肠内固有层树突状细胞释放的不同的细胞因子是否诱导不同的T淋巴细胞免疫,我们将CBir1转基因T细胞和野生型的正常C57BL/6小鼠脾树突状细胞或肠道固有层树突状细胞共培养；因TGF-β是Th17极化的必要条件,为检测肠道固有层树突状细胞诱导Th17是否有TGF-β介入,我们在T细胞培养是加入TGF-β抗体,用CBir1鞭毛蛋白刺激3天后测量上清液中细胞因子的表达。结果显示与肠道固有层树突状细胞共培养的CBir1特异性T细胞分泌IFN-γ和IL-17A；与脾树突状细胞共培养的CBir1特异性T细胞质分泌IFN-γ,不分泌IL-17A。加入TGF-β的抗体可以抑制CBir1特异性T细胞分泌IL-17A,与肠道固有层树突状细胞共培养的T细胞分泌IFN-γ增多；与脾树突状细胞共培养的T细胞IFN-γ的分泌没有增多。4.CD172α阳性肠道固有层树突状细胞促进微生物抗原特异性Th17免疫应答从野生型正常C57BL/6小鼠肠固有层分离提取CD172α阳性和CD172α阴性的肠道固有层树突状细胞,与CBirl特异性T细胞共培养,加入可以激活T淋巴细胞和树突状细胞TLR5信号通路的全长CBirl鞭毛蛋白,或加入可以激活CBir1 T细胞TLR5却不能激活树突状细胞TLR5的CBirl多肽(因为其缺少TLR5的结合位点)。加入CBir1鞭毛蛋白或CBir1多肽,CD172α+和CD172α的肠道固有层树突状细胞都可以激活T细胞释放IFN-γ；全长CBirl鞭毛蛋白只能刺激CD172α阳性肠道固有层树突状细胞诱导CBir1特异性T细胞产生IL-17A,而CBirl多肽则不能刺激CD172α阳性的肠道固有层树突状细胞诱导CBir1特异性T细胞产生IL-17A。CD172α阴性的肠固有层树突状细胞即使加入可以激活TLR5信号转导通路的全长CBir1鞭毛蛋白也不能诱导Th17细胞分化发育。5.TLR5介导CD172α阳性的肠道固有层树突状细胞诱导Th17细胞分化发育为进一步确定TLR5在介导CD172α+的肠道固有层树突状细胞诱导Th17细胞分化发育中的作用,我们从TLR5基因敲除(TLR5-/-)小鼠体内分离提取肠道固有层细胞与正常野生型小鼠的肠道固有层树突状细胞对比,比较他们在微生物抗原刺激下诱导Th17细胞分化发育的能力。同时为检测TLR5基因敲除小鼠的肠固有层树突状细胞自身诱导Th17分化的能力是否存在缺陷,我们加入TGF-β检测TLR5基因敲除的肠道固有层树突状细胞是否可以诱导Th17极化。因为全长的CBir1鞭毛蛋白可以激活肠固有层树突状细胞表面的TLR5信号转导通路,所以可以刺激野生型肠道固有层树突状细胞诱导CBirl特异性T细胞可以产生IL-17A;TLR5基因敲除小鼠肠道固有层树突状细胞不能诱导T细胞产生IL-17A；但加入TGF-β后TLR5基因敲除小鼠肠道固有层树突状细胞可以诱导T细胞产生IL-17A。野生型和TLR5-/-的肠固有层树突状细胞都可以诱导CBir1特异性T细胞分泌IFN-γ。研究结论：第一部分：1.梭状芽胞杆菌CBir1特异性TCR转基因小鼠脾和肠固有层内CBir1特异性T细胞在CBir1鞭毛蛋白刺激下释放不同细胞因子1)在微生物刺激下,胃肠道环境使效应T细胞分化为Th1和Th17,但在脾内,效应T细胞只能分化为Th1。2)全长CBir1鞭毛刺激后,脾树突状细胞和肠道固有层树突状细胞诱导Th1和Th17的功能存在差异。2.肠系膜淋巴结树突状细胞和肠固有层树突状细胞摄取CBir1刺激T淋巴细胞免疫1)MLN树突状细胞和肠道固有层树突状细胞可以摄取粘膜表面的CBir1鞭毛蛋白。2)肠腔内源性CBir1鞭毛菌跨过粘膜屏障被肠道固有层树突状细胞摄取,诱导T细胞应答。第二部分：1.脾、肠道固有层树突状细胞TLR5和CD172α的表达肠道固有层树突状细胞中CD103+的细胞比脾树突状细胞中的多。CD103阳性和CD103阴性树突状细胞的信号调节蛋白α的表达量相同。在胃肠道CD103+和CD103-树突状细胞中,大部分的CD172 α阳性的肠固有层树突状细胞也表达TLR5。2.CBir1鞭毛菌刺激固有层树突状细胞和脾树突状细胞产生不同的细胞因子,同时反映出不同的抗原递呈能力1)脾树突状细胞对细菌脂多糖刺激能产生较强的免疫反应,而对CBir1鞭毛蛋白或A4鞭毛菌刺激产生的反应较弱,提示在脾内抗原刺激树突状细胞诱导T细胞发生免疫反应主要通过TLR4信号转导通路；肠道固有层树突状细胞对LPS刺激基本无反应,而对CBir1鞭毛蛋白或A4鞭毛菌刺激产生的免疫反应较强,提示在肠道内抗原刺激树突状诱导T细胞发生免疫反应主要是通过TLR5信号转导通路。2)CBir1鞭毛蛋白刺激脾树突状细胞产生Thl型免疫应答；刺激肠固有层树突状细胞产生Th17型不同的免疫应答。3.肠固有层Toll样受体、信号调节蛋白α双阳性树突状细胞诱导Th17分化1)微生物抗原刺激CD172a阳性肠道固有层树突状细胞诱导Th17细胞分化发育是由于全长的CBirl鞭毛蛋白激活TLR5信号转导通路；但仅仅激活TLR5信号转导通路不足以启动Th17细胞发育增殖。2)TLR5基因敲除的肠固有层树突状细胞在体外诱导T细胞分化的能力没有缺陷,之所以不能诱导T细胞极化是因为缺少Th17极化的必要因素TGF-p。综上所述,Toll样受体5通过信号调节蛋白a阳性的肠固有层树突状细胞促进Th17细胞分化发育。研究意义与不足：本研究利用微生物抗原刺激流式细胞术分离的CD172a+肠固有层树突状细胞诱导Th17分化,确定了CD172α+肠固有层树突状细胞诱导微生物抗原特异性的Th17极化的能力。大部分CD172a+肠固有层树突状细胞同样会表达Toll样受体5,而TLR5缺陷的肠固有层树突状细胞不能诱导Thl7分化发育。另外,TLR5基因敲除不会影响CD172a阳性肠固有层树突状细胞分化发育。因此本研究首次确定了肠道固有层中诱导Th17分化的树突状细胞群的亚型为CD11c+CD172α+TLR5+,进一步的机制研究发现,CD172a阳性的肠固有层树突状细胞通过TLR5信号转导通路介导Th17细胞分化,从而指导树突状细胞的免疫治疗,为今后我们更深入的探讨人类消化道疾病的发病机制和防治策略提供了坚实的理论基础。该课题不足之处是脾树突状细胞在CBir1鞭毛蛋白刺激只能诱导T淋巴细胞分化为Thl型细胞的原因、肠道固有层树突状细胞表面其他Toll样受体的表达及临床意义仍需要进一步探讨。