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纳豆枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌的亚种,具有广泛的益生作用。本研究旨在评价纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto strain RNLBSN002,BSN2)作为奶牛安全饲用微生物的应用效果,并初步探讨了其发挥益生作用的机理。试验一通过对BSN2生长曲线、生理生化指标和16S rDNA分子测定,研究了BSN2的生长特性、生理生化特性;通过正交试验和单因素试验,优化了BSN2液、固态发酵的培养条件。试验结果表明,通过菌落形态、生理生化指标和16S rDNA序列测定,可判断此菌为枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)。此菌液体发酵的最佳培养条件组合为葡萄糖1%、蔗糖1%、大豆蛋白胨6%、胰蛋白胨4%、接种量2%、装液量5 mL/dL、转速180 r/min和温度37℃。1000 mL发酵容器的最适装液量为400 mL,细菌产量达到4.6×1010 cfu/mL。此菌固体发酵以豆粕为基质,添加NaC1 0.30%、蔗糖5%、大豆蛋白胨5%,蒸馏水50%,pH 6.5,接种5%(v/w)种子菌液,培养36 h时活菌数达到最大3.58×109 cfu/g,菌体蛋白含量为4.77 mg/g。发酵产物氨基酸含量较未发酵豆粕培养基有总体提高趋势,其中天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸分别提高6.29、7.32、6.99、5.08、6.63和6.81%(P < 0.05)。试验二通过瘤胃体外发酵产气试验,研究了BSN2对瘤胃体外发酵的影响。本试验以不添加BSN2为对照,动态观测基础日粮中BSN2添加量分别为0.3×1011 cfu/d(处理Ⅰ)和1.5×1011 cfu/d(处理Ⅱ)对瘤胃液体外发酵产气量、pH、氨氮和各挥发性脂肪酸含量的影响。结果表明,处理Ⅱ与对照相比,产气量提高了11.89% (P < 0.05),瘤胃pH显著降低(P < 0.05),氨氮浓度提高了16.07% (P < 0.05),乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度分别提高10.43%,50.35%和20.70%(P < 0.05)。说明BSN2培养物在基础日粮中的添加量为1.5×1011 cfu/d时能促进瘤胃微生物发酵,提高瘤胃代谢产物浓度。试验三通过动物饲喂试验,研究了BSN2对奶牛产奶性能的影响,评价此菌作为奶牛饲用微生物的效果。本试验选用36头泌乳早期荷斯坦奶牛,采用完全随机试验设计,分成3个处理组:1)对照组,基础日粮+ 60 g豆粕载体;2)处理Ⅰ,基础日粮+ 0.5×1011 cfu/d BSN2;3)处理Ⅱ,基础日粮+ 1.0×1011 cfu/d BSN2。试验期70 d,每头奶牛每天测定产奶量和采食量,每周采集牛奶样本进行乳成分测定。试验结果表明,与对照组相比较,处理Ⅱ在干物质采食量差异不显著的情况下,显著提高奶牛产奶量,4%乳脂校正乳产奶量和能量校正乳产奶量达14.7、17.0和17.4%(P < 0.05),显著提高乳中乳蛋白和乳糖含量达18.8%和15.1%(P < 0.05),乳中体细胞数log10值降低5.5%(P < 0.05)。说明BSN2具有促进奶牛奶产量,提高饲料转化效率,促进牛奶中乳蛋白和乳糖产量,降低体细胞数,改善牛奶品质的作用。试验四通过瘘管奶牛饲喂试验,研究了BSN2对奶牛产奶性能、瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响,验证此菌作为奶牛饲用微生物的效果,初步探讨此菌发挥益生作用的机理。采用4头瘘管奶牛进行为期28 d的自体前后配对饲喂试验。分成3个处理阶段:1)试验期第1～7 d,饲喂基础日粮+ 60 g豆粕培养基,即对照组;2)试验期第8～21 d,饲喂基础日粮+ 1.0×1011 cfu/d BSN2,即处理组;3)试验期第22～28 d,饲喂基础日粮+ 60 g豆粕培养基,即停喂组。试验结果表明,不同处理期奶牛干物质采食量差异不显著。与对照期比较,BSN2处理期奶牛产奶量显著增加,奶中乳蛋白和乳糖产量增加(P < 0.05),瘤胃pH降低(6.64 vs. 6.46, P < 0.05),氨氮、总挥发性脂肪酸和丙酸摩尔比显著提高37.7、47.4和6.4%,乙酸摩尔比显著降低1.9%,乙酸/丙酸降低(3.23 vs. 3.02,P < 0.05)。传统培养法结果表明,与对照期相比,BSN2处理期奶牛瘤胃中瘤胃细菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌和原虫数量显著增加;实时定量PCR结果表明,试验期奶牛瘤胃纤维分解菌,包括溶纤维丁酸弧菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌数量分别提高6.97%、4.51%和9.6%(P < 0.05),两种淀粉分解菌,牛链球菌和嗜淀粉瘤胃杆菌分别提高25.4%和14.6%(P < 0.05),乳酸利用菌埃氏巨球型菌也提高8.85%(P < 0.05)。普雷沃氏菌,包括布氏普雷沃氏菌、普雷沃氏菌短杆菌及普雷沃氏菌属均有显著提高,总细菌数和原虫纤毛虫数量显著提高。说明BSN2具有促进瘤胃某些瘤胃微生物种类生长的作用,促进瘤胃发酵,从而改善奶牛奶产量和乳成分产量。因此,BSN2具有作为奶牛饲用益生菌的潜力。