三种杜鹃花瓣培养基对链格孢非寄主选择性毒素影响机制的研究

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贵州百里杜鹃花自然保护区是中国已发现的最大的原生杜鹃花林,也是中国唯一保护高山杜鹃花的自然保护区,被誉为“杜鹃花王国和地球彩带”。但近年来,随着气候变化和人类活动的增加,景区内杜鹃花病害频发。杜鹃花花瓣枯萎病是自然保护区最具传染性和破坏性的病害,严重降低了花卉的观赏价值和繁殖能力。本研究以从杜鹃花瓣枯萎病中分离出的细极链格孢(Alternaria tenuissima)MR-9为实验材料,通过微生物单孢分离和系统发育分析,保证单孢分离前后菌株的一致性。以PDA为对照组,测定菌体中链格孢酚(AOH)、链格孢酚单甲醚(AME)、链格孢酮酸(Te A)、链格孢烯(ALT)含量,测定菌体总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。根据实验结果,选择200g花瓣马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为处理组,普通PDA培养基作为对照组。此外,利用荧光定量PCR检测细胞色素P450代谢作用通路基因对外源物质的表达及毒素合成等相关基因的表达情况,为花瓣枯萎病的防治提供科学依据。本研究主要研究结果如下:1、将课题组前期分离的杜鹃花瓣枯萎病致病菌株细极链格孢菌株MR-9接在PDA在内的16种杜鹃花瓣培养基中培养,观察培养基对菌株生长的影响,并测定其生物量。结果显示,与对照组相比,随着杜鹃花瓣添加量的增多,MR-9的生长速度逐渐加快,菌落直径逐渐增大;菌落边缘逐渐疏松并呈放射状;插片处理中的菌丝直径逐渐变小,菌丝逐渐稀疏;生物量逐渐升高。表明杜鹃花瓣中的成分能够促进MR-9菌株的生长,但抑制菌丝直径和菌丝数量的增加。2、将MR-9接在PDA在内的16种培养基中培养,利用高效液相色谱仪(High performance liquid chromatography,HPLC)测定其在16种不同颜色和比例花瓣的产毒量。结果表明,与对照组相比,花瓣+PDA培养下MR-9的ALT、AOH和AME随花瓣添加量的增加而降低,Te A随花瓣添加量的增加而升高,纯花瓣培养下的MR-9的4种毒素均降为零。表明杜鹃花瓣的添加质量对毒素的影响不一致。3、对培养在16种杜鹃花瓣培养基中的MR-9菌体中的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性进行测定。结果显示,与对照组相比,MR-9菌体中的T-AOC和SOD活性随杜鹃花瓣添加量的增加而升高;MR-9菌体中的CAT随杜鹃花瓣添加量的增加呈现先上升后降低的趋势。表明三种杜鹃花瓣会对MR-9造成氧化胁迫,并随花瓣添加量的增加胁迫逐渐增强。4、基于前期对MR-9毒素含量以及氧化代谢相关酶活性的数据,选择以PDA为对照组,以200 g迷人杜鹃+PDA(200 g MR+PDA)、200 g红花露珠杜鹃+PDA(200 g HHLZ+PDA)和200 g露珠杜鹃+PDA(200 g LZ+PDA)为处理组进行荧光定量PCR测定其相关基因表达量。结果表明,与对照组相比,200 g MR+PDA、200 g HHLZ+PDA和200 g LZ+PDA处理下的MR-9在P450对外源物质的代谢通路中的部分基因(SFA1、TRX1、Mgst1、hmg X、adh)发生显著变化,毒素合成相关基因(TAS1、TES1、TES、AKT7、afl V、orf6)的表达量均发生显著下调。表明杜鹃花瓣能够抑制链格孢毒素合成基因的表达量进而降低链格孢的产毒。
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