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类胡萝卜素是柑橘果实的主要呈色色素。近年来,柑橘橙红或深红色果肉品种由于其特殊的营养价值和保健功能而备受消费者青睐,具有强大的市场竞争力。红肉脐橙是华盛顿脐橙的芽变,其果肉主要含有番茄红素和β-胡萝卜素,是迄今世界上唯一果肉粉红的脐橙品种。本研究以红肉脐橙为实验材料,对其类胡萝卜素生物合成关键酶基因(CsPSY和CsLCYbs)的功能进行分析,以期为柑橘果实红肉性状形成机理提供更多理论依据。此外,利用细菌八氢番茄红素合成酶基因(crtB)转化柑橘愈伤组织和上胚轴,对获得的转基因株系进行了表型比较、分子鉴定、细胞学观察、代谢产物测定等研究,并对crtB转基因促进柑橘类胡萝卜素生物合成的机理进行了初步探讨。主要研究结果如下：1、红肉脐橙CsPSY功能特性分析。1)红肉脐橙CsPSY cDNA包含1个1308 bp的完整读码框,编码436个氨基酸,预测的分子量为49.5kD。CsPSY推导的氨基酸序列与其它植物PSY的同源性达70%以上,与藻类、蓝细菌和细菌的同源性则依次降低,分别为54-58%、45-47%和26-29%,表明PSY在物种进化过程中是一个高度保守的蛋白。CsPSY推导的氨基酸序列在N-端144个氨基酸区域有一个质体定位信号肽,在260-282氨基酸区域有1个跨膜区。2)Real time RT-PCR对CsPSY表达谱分析表明,CsPSY表达量随着果实发育成熟而上升；红肉脐橙有色层、白皮层和囊衣中CsPSY表达量较华盛顿脐橙高,而汁胞中CsPSY表达量在两个品种间没有明显差异。3)构建了CsPSY的原核表达载体pET-CsPSY,并通过大肠杆菌异源表达证实CsPSY编码一个功能蛋白,可催化2个分子GGPP缩合形成八氢番茄红素。4)构建了CsPSY的植物表达载体pBI-CsPSY,通过农杆菌侵染法转化山金柑,获得CsPSY转基因山金柑植株5株。HPLC分析表明,CsPSY转基因山金柑果实中类胡萝卜素含量平均增加2.0倍,八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素和β-隐黄质含量分别增加了2.1,2.5,2.0和2.3倍,表明CsPSY过量表达促进了转基因山金柑果实中类胡萝卜素的生物合成和积累。Real-time RT-PCR分析表明,转基因山金柑果实中PSY表达量增加4-6倍,但除PDS和ZDS的表达有少量增加外,CRTISO的表达量变化不明显,而其它下游基因LCYe、LCYb、HYb和ZEP的表达也未发生明显变化。2、红肉脐橙CsLCYbs功能特性分析。1)红肉脐橙CsLCYb1和CsLCYb2 cDNA (GeneBank登录号为FJ851307和FJ851308)均包含1个1512 bp的完整读码框,编码504个氨基酸,预测的分子量为56.5kD。CsLCYb1和CsLCYb2在核苷酸和氨基酸水平上同源性达98%,主要区别是23个核苷酸变化,导致两个蛋白的氨基酸序列在第4,23,39,50,164,235,332,439,446,469,477位等多处存在差异。CsLCYb1和CsLCYb2推导的氨基酸序列与其它植物LCYb的同源性达70%以上,与藻类、蓝细菌和细菌的同源性则依次降低,分别为50-54%、35-46%和26-29%,表明LCYb在物种进化过程中也是一个高度保守的蛋白。CsLCYbl推导的氨基酸序列在85-106,206-227,373-391和460-480氨基酸区域有4个跨膜区,而CsLCYb2推导的氨基酸序列在85-106,206-227和373-391氨基酸区域有3个跨膜区。2)Real time RT-PCR对CsLCYb1和CsLCYb2表达谱分析表明,CsLCYb1和CsLCYb2表达在果实发育过程中呈相似的变化趋势,CsLCYb2表达量高于CsLCYb1。红肉脐橙有色层和白皮层中CsLCYb1和CsLCYb2的表达量在果实发育早期(8-9月)较华盛顿脐橙低,在果实发育后期(10-12月),红肉脐橙有色层中CsLCYb1和CsLCYb2的表达量仍低于华盛顿脐橙,而白皮层中CsLCYb1和CsLCYb2的表达量则高于华盛顿脐橙。红肉脐橙汁胞中CsLCYb1和CsLCYb2的表达量在整个果实发育成熟过程中一直低于华盛顿脐橙,而在囊衣中,CsLCYb1和CsLCYb2的表达量在两个品种间没有明显差异。3)构建了CsLCYb1和CsLCYb2的原核表达载体pET-CsLCYb1和pET-CsLCYb2,并通过大肠杆菌异源表达证实CsLCYb1和CsLCYb2均可编码功能蛋白,催化番茄红素两个末端均形成p-环,生成p-胡萝卜素。与CsLCYb1相比,CsLCYb2催化效率较低,从而导致中间产物单环Y-胡萝卜素积累。4)构建了CsLCYb1和CsLCYb2的植物表达载体pBI-CsLCYb1和pBI-CsLCYb2,通过农杆菌侵染法转化番茄,获得CsLCYb1和CsLCYb2转基因番茄植株分别为12株和6株。HPLC分析表明,CsLCYb1转基因番茄成熟果实由于积累大量β-胡萝卜素而呈现明显的橙色表型,CsLCYb2转基因番茄果实则没有明显变化。这些结果表明CsLCYb1过量表达促进了转基因番茄果实中的番茄红素向β-胡萝卜素转化,而CsLCYb2过量表达则对转基因番茄果实中β-胡萝卜素的形成没有明显影响。3、植物表达载体pBl-ts-rbcS-crtB构建及转化番茄验证其功能。构建了细菌八氢番茄红素合成酶基因crtB的植物表达载体pBI-ts-rbcS-crtB,并通过农杆菌侵染法对番茄进行转化,获得crtB转基因番茄植株15株。HPLC分析表明,crtB转基因番茄果实中类胡萝卜素含量较野生型增加了1.3-2.5倍,八氢番茄红素、番茄红素、p-胡萝卜素和α-胡萝卜素分别增加了4.3、1.8、2.2和2.3倍,表明crtB过量表达促进了转基因番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。Real-time RT-PCR分析表明,crtB转基因株系中GGPS表达下降；PSY1、PSY2、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb、BCH表达上升；LCYe和ZEP表达在大部分转化株系中没有明显变化,表明crtB过量表达对番茄果实内源类胡萝卜素生物合成相关基因的表达具有广泛影响。4、过量表达crtB提高柑橘愈伤组织中类胡萝卜素含量。利用农杆菌侵染法将crtB转入柑橘伏令夏橙(FXC)(Citrus sinensis)与改良橙×尾张(GWZ)(Citrus sinensis×Citrus reticulata)愈伤组织,获得的转基因愈伤组织和胚状体由于β-胡萝卜素大量积累而呈现明显的橙黄色或橙色表型。HPLC分析表明,crtB转基因GWZ愈伤组织和胚状体中β-胡萝卜素含量较野生型增加了6.1倍和20.9倍,crtB转基因FXC愈伤组织和胚状体中β-胡萝卜素含量较野生型增加了4.1倍和9.8倍。光学显微镜观察表明crtB转基因愈伤组织和胚状体中分化形成了有色体,类胡萝卜素主要是以橙色或橙红色片状结构储存；透射电子显微镜观察表明crtB转基因愈伤组织和胚状体中类胡萝卜素主要是以质体小球结构形式储存于有色体。这些结果表明,crtB转基因愈伤组织和胚状体中类胡萝卜素的积累与crtB过量表达促使转基因愈伤组织和胚状体中特定类胡萝卜素储存结构形成,从而使类胡萝卜素的储存能力提高有关。Real-time RT-PCR分析表明,crtB转基因愈伤组织和胚状体中PSY、PDS、IDS、CRTISO、LCYb和LCYe表达呈上升趋势,BCH和ZEP表达则表现为下降趋势,表明crtB转基因愈伤组织和胚状体中类胡萝卜素生物合成及其特征性类胡萝卜素(β-胡萝卜素)积累与crtB过量表达诱导转基因愈伤组织和胚状体中类胡萝卜素生物合成内源基因PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb、LCYe和BCH、ZEP等协调表达,从而使类胡萝卜素的合成能力增强有关。5、柑橘crtB转基因植株培育和初步分析。利用农杆菌侵染法将crtB转入柚×葡萄柚(Cocktail) (Citrus grandis×Citrus paradisi, Cocktail)和早实枳(Poncirus trifoliata),获得Cocktail葡萄柚和早实枳卡那霉素抗性植株分别为86株和36株。PCR和Southern blot分析表明,获得crtB转基因Cocktail葡萄柚阳性植株4株,且为1-2个拷贝插入；获得crtB转基因早实枳阳性植株12株,且为2-4个拷贝插入。RT-PCR检测证实,crtB在葡萄柚和早实枳转基因株系中得到表达。HPLC分析表明,crtB转基因Cocktail葡萄柚叶片中类胡萝卜素含量较未转基因对照降低约25%-30%,α-和β-胡萝卜素含量分别降低40-50%和20-40%；而crtB转基因早实枳叶片中类胡萝卜素含量较未转基因对照增加了1.3-1.7倍,α-和β-胡萝卜素含量分别增加了1.2-1.6倍和1.5-2.0倍。可见,crtB过量表达对柑橘叶片中类胡萝卜素合成和积累效应因基因型(Cocktail葡萄柚和早实枳)不同而产生明显差异,这可能与叶片中类胡萝卜素和叶绿素生物合成及其复杂的调控机制有关。