背景:胰腺癌（pancreatic cancer,PC）起病隐蔽,通常无或少有早期症状,大多数患者确诊即为中晚期,患者预后极差,五年生存率不足8%。胰腺癌的传统治疗受限颇多,早期胰腺癌可切除,但术后复发率和远端转移率极高,中晚期患者难以进行手术切除,且大部分患者对放疗不敏感,化疗疗效同样有限。近年来新兴的靶点治疗正成为研究热点,而胰腺癌的转移侵袭是影响患者预后的重要因素。因此,进行胰腺癌转移侵袭机制相关的研究,探索其中关键的靶点基因对于胰腺癌靶点治疗具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是近年来的研究热点,本身不编码蛋白但可以从转录、转录后、表观遗传等多水平调控基因表达,并在机体的发育和细胞分化等多方面起到重要作用。lncRNA具有多种作用机制,它可以结合特定蛋白,改变蛋白的活性和细胞定位;它可以使染色质重构或影响编码基因上游转录来调节下游基因表达;一些包括lncRNA在内的分子存在与微小RNA（microRNA,miRNA）的结合位点,在细胞中大量吸附miRNA并减少miRNA与其下游mRNA靶点的结合,从而减弱miRNA对下游mRNA靶点的抑制作用,该作用机制被称为竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）。lncRNA锌指蛋白反义链1（ZNFX1-antisence 1,ZFAS1）在包括心血管疾病,炎症及多种肿瘤中均异常表达,但在胰腺癌内鲜有相关报道。ZFAS1在胰腺癌内的表达水平、是否存在调控胰腺癌的生物学功能及其潜在机制均尚未清楚,亟需进一步研究。目的:本课题旨在预测并验证ZFAS1在胰腺癌组织和细胞内的表达水平;分析ZFAS1的临床相关性,评估ZFAS1作为胰腺癌诊断指标的价值;预测并验证ZFAS1是否存在调控胰腺癌转移侵袭的生物学功能和其潜在机制。研究方法:本课题通过人胰腺癌组织芯片、体外细胞实验和体内动物模型从现象、功能和机制三个水平逐层深入,探求ZFAS1在胰腺癌内的作用。临床标本方面首先通过生物信息学数据库预测ZFAS1在胰腺癌内的表达差异情况,并根据ZFAS1表达值将整体数据分为ZFAS1表达高低两组,进行基因探针富集分析,预测ZFAS1高表达相关的肿瘤相关的生物学功能。然后通过原位杂交检测ZFAS1在人胰腺癌和癌旁组织中的表达差异,确定ZFAS1的亚细胞定位,并结合患者随访信息和临床病理学资料分析ZFAS1与胰腺癌的临床相关性。体外实验方面通过瞬时转染敲减ZFAS1表达,RT-PCR检测转染效率,并通过细胞划痕实验和transwell迁移实验检测ZFAS1对胰腺癌转移侵袭是否存在影响。生物信息学预测与ZFAS1结合的miRNA miR-3924的结合位点,构建ZFAS1稳定沉默的胰腺癌细胞系并通过相应的双荧光素酶报告实验及对应的细胞划痕和transwell迁移实验的挽救实验确定ZFAS1竞争性内源性结合miR-3924调控胰腺癌转移侵袭的具体机制,western blot检测ZFAS1沉默或miR-3924过表达后集落粘附通路FAK、RHOA和miR-3924直接靶点ROCK2的表达水平,进一步验证ceRNA机制。体内实验方面建立裸鼠尾静脉转移模型,择期处死裸鼠后通过苏木精-伊红（HE）染色观察肝肺转移集落数来验证ZFAS1敲减对于胰腺癌SW1990细胞系体内肝肺转移侵袭的影响。研究结果:包括临床组织验证、体外验证和体内验证三部分。临床组织相关验证结果1、GEO数据库中汇合标准化后的数据集差异表达分析结果显示,ZFAS1在胰腺癌内的表达水平明显高于癌旁;TCGA和ONCOMINE数据库数据集得出了同样的结果;TCGA源性数据库分析显示,ZFAS1高表达与患者饮酒习惯、性别和肿瘤分期相关。2、原位杂交结果显示,ZFAS1在人胰腺癌组织内表达水平明显高于癌旁;ZFAS1在胞核胞浆中均有分布。3、预后分析提示,ZFAS1高表达的患者预后明显不良;ZFAS1表达水平与肿瘤病理分级（P=0.576）、患者TNM分期（P=0.431）、性别（P=0.794）、年龄（P=0.798）肿瘤大小（P=0.279）、神经浸润（P=1）和淋巴转移（P=0.285）无关;ROC曲线提示,曲线下面积0.747。4、基因探针富集分析结果显示,ZFAS1在胰腺癌内的高表达与集落粘附通路、细胞外基质受体相互作用及mTOR通路相关,其中与集落粘附通路相关性最高。体外实验结果1、ZFAS1在胰腺癌细胞系中表达水平同样高于胰腺正常导管上皮细胞;瞬时转染中si-ZFAS1相比si-NC明显降低了ZFAS1在胰腺癌细胞系BXPC-3和SW1990细胞系中的表达水平;Transwell迁移实验显示,ZFAS1敲减明显减少了胰腺癌细胞系BXPC-3和SW1990上室迁往下室的细胞数量;细胞划痕实验显示,ZFAS1敲减明显降低了胰腺癌细胞系BXPC-3和SW1990的迁移率。2、生物信息学数据库预测显示,miR-3924存在与ZFAS1结合位点;双荧光素酶报告显示,野生型荧光素酶质粒组的萤火虫酶和海肾酶的比值明显高于突变型荧光素酶质粒组,提示miR-3924和ZFAS1的直接结合;同时,Transwell迁移实验显示,miR-3924的过表达明显减少了胰腺癌细胞系BXPC-3和SW1990上室迁往下室的细胞数量;细胞划痕实验显示,miR-3924的过表达明显降低了胰腺癌细胞系BXPC-3和SW1990的迁移率。3、慢病毒构建ZFAS1稳定沉默的胰腺癌细胞系BXPC-3和SW1990,并用适量嘌呤霉素进行筛选,RT-PCR结果显示,ZFAS1稳定沉默;在ZFAS1稳定沉默的BXPC-3和SW1990细胞系中转染miR-3924 inhibitor抑制miR-3924表达,Transwell迁移实验显示,miR-3924的抑制逆转了ZFAS1沉默对细胞从上室迁移到下室的数量的影响;细胞划痕实验显示。miR-3924的抑制逆转了ZFAS1沉默对细胞迁移率的影响。4、生物信息学数据库预测miR-3924下游靶点ROCK2和miR-3924的结合位点;双荧光素酶报告实验显示,野生型荧光素酶质粒组的萤火虫酶和海肾酶的比值明显高于突变型荧光素酶质粒组,提示miR-3924和ROCK2的直接结合;Western blot结果显示,ZFAS1的敲减和miR-3924的过表达均可降低ROCK2以及集落粘附通路中ROCK2上游的RHOA和FAK的蛋白表达水平。体内实验结果裸鼠尾静脉转移侵袭模型结果显示,裸鼠肝脏和肺脏组织切片HE染色表明ZFAS1的稳定沉默明显减少了裸鼠体内胰腺癌的肝转移集落数。结论:1、ZFAS1在胰腺癌内表达水平明显高于癌旁。2、ZFAS1表达水平与胰腺癌患者预后相关。3、ZFAS1促进胰腺癌体内外的转移侵袭。4、miR-3924抑制胰腺癌体外转移侵袭。5、ZFAS1通过竞争性内源性结合miR-3924调控下游靶点ROCK2影响胰腺癌转移侵袭。