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第一部分从调控胰岛细胞身份相关转录因子探讨黄连人参对药改善db/db小鼠糖代谢的作用机制目的从调节胰岛细胞相关身份因子探讨黄连人参对药(HRD)改善db/db小鼠糖代谢的作用机制方法采用7-8周龄db/db(C57BL/KS-db/db)小鼠作为2型糖尿病(T2DM)模型,同窝db/m(C57BL/KS-db/m)为正常对照组。根据db/db小鼠初始空腹血糖(FBG)和体重水平,随机数字表法将db/db小鼠分为模型组、低剂量黄连人参对药组(LHRD:3.03g/kg/d)、高剂量黄连人参对药组(HHRD:6.06g/kg/d)和沙格列汀组(SAX:10mg/kg/d),另外对照组与模型组给予生理盐水,连续灌胃治疗8周。每周尾静脉采血检测小鼠FBG及检测体重和24h进食量;干预结束时进行腹腔注射糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐受实验(IPITT);Elisa检测血清胰岛素;免疫荧光检测胰岛素、胰高血糖素、Nkx6.1、Pdx1、Ki67和Caspase12;Western Blotting检测Cleaved caspase3/Caspase3、Bax/Bcl2及Ngn3蛋白表达水平;免疫组化检测Cleaved Notch1和Ngn3表达水平。统计方法,若数据符合正太分布且方差齐,则采用LSD进行统计学差异分析,若方差不齐,则使用Dunnett T3检验方法。若数据为非正态分布,采用非参数检验。当P<0.05表示存在显著差异性。结果HRD具有显著改善糖代谢的作用。与正常对照组比较,模型组FBG显著升高(P<0.0001);与模型组比较,HRD组FBG显著降低,尤其是HHRD组(P<0.05);IPGTT与IPITT结果显示,与正常对照组比较,模型组小鼠血糖水平在各个时间点均显著升高(P<0.0001);与模型组比较,LHRD组及SAX组在IPGTT中90min和120min时血糖显著降低(P<0.05),同时SAX组在IPITT中60min、90min和120min时血糖显著降低(P<0.05),HHRD组小鼠分别在IPGTT中90min和IPITT中120min的血糖显著降低(P<0.05,P<0.01),其余无明显变化;与正常对照组比较,模型组空腹血清胰岛素(FINS)显著升高(P<0.01);与模型组比较,HHRD组和SAX组FINS升高明显(P<0.05,P<0.001);与正常对照组比较,模型组IPGTT曲线下面积(AUC)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著升高,与模型组比较,LHRD组与HHRD组显著降低(P<0.05,P<0.01)。除了改善糖代谢外,HRD还能维持胰岛细胞身份。与正常对照组比较,模型组Glucagon+细胞/Insulin+细胞比例显著升高(P<0.01);与模型组比较,LHRD组和HHRD组显著改善(P<0.05,P<0.01);与正常对照组比较,模型组中胰岛的Nkx6.1+Insulin+细胞比例显著降低(P<0.01),而Pdx1+Insulin+Glucagon+共表达细胞比例显著上升(P<0.001);与模型组比较,LHRD组及HHRD组可显著提高Nkx6.1+Insulin+细胞比例(P<0.05),同时HHRD组还能显著减低Pdx1+Insulin+Glucagon+共表达水平(P<0.05)。HRD亦能调节Notch1-Nng3信号通路相关蛋白。与正常对照组比较,模型组胰岛中Cleaved Notch1表达明显降低;与模型组比较,HHRD组胰岛中Cleaved Notch1表达明显升高;与正常对照组比较,模型组胰岛中Ngn3明显升高(P<0.01);与模型组比较,LHRD组与HHRD组胰腺中Ngn3明显降低(P<0.05,P<0.01)。HRD对胰岛细胞的增殖和凋亡无明显影响。与正常对照组比较,模型组中胰腺组织Caspase12共表达明显升高;与模型组比较,各干预组中胰岛的Caspase12明显降低;而与正常对照组比较,模型组Ki67,Bax/Bcl2,Cleaved caspase3/Caspase3无明显差异;与模型组比较,各治疗组无明显差异。另外,与正常对照组比较,模型组的胰岛数量、胰岛面积大小及胰岛形态亦无明显改变,与模型组比较,各治疗组无明显差异。结论黄连人参对药可以显著改善db/db小鼠糖代谢紊乱,可能与其调节Notch1-Ngn3信号通路从而维持胰岛细胞身份有关。第二部分基于Notch1-Ngn3信号通路初步探讨黄连人参对药活性成分对MIN6细胞去分化的调节作用目的胰岛细胞去分化是2型糖尿病新的病理机制,从NOTCH1-NGN3信号通路初步探讨黄连人参对药活性成分小檗碱(BBR)与人参皂甙RB1(RB1)对MIN6细胞身份因子的调节作用。方法MTT比色法确定棕榈酸(PA)及Rb1,BBR及Notch1特异性阻断剂DAPT的干预浓度。按照不同的药物干预,分为Rb1组、BBR组、RB(Rb1+BBR)组及RBD(Rb1+BBR+DAPT)组,另外再设置模型组和正常对照组。Elisa检测GSIS实验中细胞上清液胰岛素(INS)含量、氧化酶法测细胞上清液葡萄糖(Glucose)含量,计算细胞葡萄糖消耗;免疫荧光检测MIN6细胞Nkx6.1、Ki67、Ngn3和Cleaved Notch1的表达量;免疫印迹检测Cleaved Notch1、Ngn3、Nkx6.1、Cleaved caspase3/Caspase3、Caspase12蛋白水平;rt PCT检测细胞中Ngn3、Nkx6.1 m RNA含量。统计方法,若数据符合正太分布且方差齐,则采用LSD进行统计学差异分析,若方差不齐,则使用Dunnett T3检验方法。若数据为非正态分布,采用非参数检验。当P<0.05表示存在显著差异性。结果0.1mmol/L及0.2mmol/L的PA能显著降低MIN6细胞活性(P<0.01,P<0.0001),选取此两种PA浓度,分别干预0h、2h、4h、8h、16h及24h。与正常对照组比较,0.2mmol/L PA干预24h后,转录因子Nkx6.1在蛋白及m RNA水平显著降低(P<0.05,P<0.0001),去分化标志物Nng3 m RNA含量显著升高(P<0.01),Caspase3蛋白及m RNA水平无明显变化,提示胰岛β细胞去分化模型成功。MTT比色法显示,与正常对照组比较,Rb1、BBR及DAPT干预24h的无毒最大浓度为分别40μmol/L、2.5μmol/L和20μmol/L,设为干预浓度。与正常对照组比较,模型组Nkx6.1在蛋白水平及m RNA水平表达明显降低(P<0.001,P<0.01);与模型组比较,Rb1组及RB组Nkx6.1在转录和翻译水平明显升高(P<0.05,P<0.01),BBR组及RBD组则无明显改善,免疫荧光也提示相同的趋势;与正常对照组比较,模型组Caspase12、Cleaved caspase3/Caspase3无明显差异,免疫荧光检测Ki67亦无显著变化;与模型组比较,各干预组均无明显改变;与正常对照组比较,模型组的Cleaved Notch1显著降低;与模型组比较,Rb1组、BBR组及RB组Cleaved Notch1表达升高,而RBD组显著降低;与正常对照组比较,模型组Ngn3的m RNA水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,Rb1组、BBR组及RB组m RNA明显降低(P<0.01),而RBD组显著升高(P<0.05),但在蛋白表达水平上,各组间无显著性差异。GSIS实验显示,与正常对照组比较,模型组在低糖(2.8m M)刺激下胰岛素分泌增加;与模型组比较,除BBR组胰岛素水平降低外,其余干预组均升高,而在高糖(16.7m M)环境下,与正常组比较,模型组胰岛素分泌明显降低;而各干预组明显升高,尤其是BBR组升高更明显;与正常对照组比较,模型组细胞葡萄糖消耗降低(P<0.01);与模型组比较,BBR组及RB组细胞葡萄糖消耗明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论0.2mmol/L棕榈酸干预24h可诱导MIN6细胞去分化,黄连人参对药活性成分显著改善MIN6细胞身份因子表达,尤其是Rb1作用更显著,这一作用与调节Notch1-Ngn3信号通路密切相关。