羟基自由基（·OH）是生物体系中氧化性最强的一类活性氧（ROS）,主要通过芬顿反应和哈伯-韦斯反应产生,并且能以扩散控制速率与DNA、蛋白质、脂质和氨基酸等多种生物分子发生反应。当生物体内·OH含量异常时,会导致细胞损伤、DNA/蛋白质突变和各种疾病发生。生物医学研究表明,通过调控生物体内·OH的含量可实现对癌症等临床疾病的治疗。因此,为进一步深入研究·OH的性质和生物功能,研究其治疗用途,开发灵敏、动态检测生物体系中·OH的方法具有非常重要的意义。荧光探针具有灵敏度高、无创性和时空分辨率高等优点,目前已成为检测生物体系中活性氧的有力分子工具。荧光探针结合成像技术可实现对生物体活性氧的原位、动态及可视化监测。内源性·OH具有寿命短、扩散速度快且在细胞中浓度低等特点,因此,开发灵敏、选择性检测生物体系中·OH的荧光探针仍然面临巨大的挑战。本论文基于神经保护药物依达拉奉对·OH的清除机制,将依达拉奉与荧光染料分子有机结合,分别构建了专一检测·OH和同时检测·OH和pH的荧光探针,并对它们的性质及生物成像应用进行了研究。论文内容主要分为以下三章:第一章绪论。简要介绍了基于不同机理检测·OH荧光探针的研究进展,并在此基础上提出了本论文的研究思路。第二章以依达拉奉为识别基团专一检测羟基自由基的罗丹明类荧光探针构建及应用研究。本章基于依达拉奉对·OH的高效清除反应,构建了一种以依达拉奉为识别基团专一检测·OH的开启型荧光探针RH-EDA。探针RH-EDA分子是一个罗丹明与依达拉奉的杂化体,其结构中的3-甲基吡唑啉酮部分可特异性识别·OH,从而调控检测体系的荧光信号。由于探针RH-EDA存在扭曲的分子内电荷转移（TICT）（主要因素）和其结构中罗丹明3’位氮原子被酰化（次要因素）,导致探针RH-EDA在水溶液中几乎无荧光。RH-EDA的3-甲基吡唑啉酮部分可与·OH反应生成RH-OPB,从而导致探针分子内TICT效应被抑制且探针中罗丹明3’位氮原子去酰化,上述因素共同作用导致检测体系在579 nm处的荧光信号显著升高。探针RH-EDA检测·OH具有灵敏度高、选择性好等优点。实验结果表明,该探针可用于不同刺激下活细胞和斑马鱼中内源性·OH的成像分析。此外,通过应用该探针监测β-拉帕醌诱导下癌细胞和正常细胞中内源性·OH水平差异,可明显区分癌细胞和正常细胞。第三章以依达拉奉为识别基团同时检测羟基自由基和pH的香豆素类荧光探针构建及应用研究。本章构建了一种以7-二乙基氨基香豆素为母体同时检测·OH和pH的荧光探针Cou-EDA。由于探针Cou-EDA的pKa为5.97,因而在生理pH条件下,其吡唑啉酮主要以烯醇阴离子形式存在。向探针溶液中加入·OH后,该基团能够特异性识别·OH,从而生成Cou-OPB。在中性条件下,Cou-OPB结构中的亚胺大部分会被质子化形成相应的亚胺阳离子,随后其与香豆素的羰基形成分子内氢键,导致其共轭体系延长,检测体系最大发射波长从507 nm红移至538 nm。因此,检测体系在538nm处的荧光信号与·OH浓度在一定范围内成正比;另一方面,当探针溶液的pH降低时,烯醇阴离子形式会转变为相应的酮式,从而导致检测体系在507 nm处的荧光信号显著升高。因此,探针Cou-EDA可实现在黄色通道(λex/λem=510/538 nm)及绿色通道(λex/λem=450/507 nm)对·OH和pH的同时检测。实验结果表明,探针Cou-EDA可应用于Hela细胞中外源性·OH和pH的荧光成像分析。此外,应用该探针研究了肉桂醛诱导的细胞凋亡过程中细胞内·OH及pH值的动态变化过程。结果表明细胞凋亡过程中,细胞内·OH含量升高且同时伴随着pH降低。