目的:对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）作为临床上广泛使用的解热镇痛药,其肝毒性是引起急性肝衰竭的主要原因。高热量高脂饮食的生活习惯使得非酒精性脂肪性肝（non-alcoholic fatty liver,NAFL）损伤的患病率在全球范围越来越高。然而,APAP或者高脂饮食诱导肝损伤都在不同程度上发生氧化应激、代谢异常、炎症等反应,在探索APAP和NAFL损伤的病理进程中明确其机制对于治疗策略的确定显得尤为重要。最新研究表明,法尼酯X受体（Farnesoid X receptor,FXR）是药物性肝损伤、肝脏和代谢等疾病的关键靶点,其激动剂有望成为多种肝脏疾病的潜在治疗剂。夏佛塔苷（Schaftoside,SS）是广金钱草的主要黄酮类活性成分,具有抗炎、抗氧化、保肝护肝的药理作用。本课题在夏佛塔苷药理学研究中发现,夏佛塔苷能够激活FXR及其靶基因,而FXR作为肝病研究热点基因在SS发挥药效中是否重要不清楚。本实验研究SS对APAP诱导毒性肝损伤和高脂饮食诱导的脂肪性肝损伤的保护作用并阐述相关分子机制。方法:1.SS作为FXR的配体激活FXR及其靶基因运用分子对接初步评估SS与FXR-LBD是否结合。然后构建FXR（Nr1h4）表达质粒和BSEP启动子质粒,转染到HEK293T细胞上,采用SS药物干预,双荧光素酶报告基因检测启动子活性。SS能否激动FXR及其靶基因,运用qRT-PCR、western blot和细胞免疫荧光验证这一观点。最后,运用hFXR siRNA沉默FXR,qRT-PCR、western blot和免疫荧光检测mRNA和蛋白表达水平再次验证FXR在SS激活下游靶基因中的重要性。2.SS对APAP诱导的炎症和肝损伤的保护作用及分子机制研究将SPF级雄性C57BL/6小鼠36只,随机分成6组,每组6只,分为正常组、模型组、奥贝胆酸组（OCA,20mg/kg）、SS低剂量组、中剂量组、高剂量组（40mg/kg,80 mg/kg,160 mg/kg）。除正常组和模型组外,各组每天灌胃给药一次,共给药7天。于第7天禁食12h后,除正常组外其余各组给予APAP（300mg/kg）12h后,取样。对肝损伤指标丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）进行检测,H&E病理组织染色、TUNEL实验进行病理学分析,再运用qRT-PCR、western blot、免疫荧光、免疫组化、LC-MS/MS检测等实验手段对氧化应激、炎症、APAP代谢相关的指标和基因mRNA、蛋白表达进行检测。提取分离培养小鼠原代肝细胞,APAP给药诱导建立细胞损伤模型,对细胞损伤指标ALT、AST进行检测,并通过CCK-8细胞增殖毒性实验、TUNEL实验、线粒体膜电位（JC-1）检测实验评估SS对于APAP诱导的细胞损伤和死亡的保护作用;检测细胞谷胱甘肽（GSH）含量,western blot检测P38、JNK及其磷酸化蛋白表达,免疫荧光检测ROS含量表达评估SS对APAP诱导细胞氧化应激的保护作用。建立LPS诱导细胞炎症模型,评估SS对炎症因子产生的抑制作用,ELISA检测细胞炎症因子的含量以及qRT-PCR检测相应mRNA的表达;将装载NF-κB或（和）FXR+NF-κB的质粒转染到HEK293T细胞中,运用LPS诱导炎症,SS进行药物干预,双荧光素酶报告基因检测NF-κB活性评估SS通过FXR和NF-κB发挥抗炎作用,并运用western blot和免疫荧光作进一步验证。3.证明FXR在SS缓解APAP诱导的炎症和肝损伤作用中重要性运用 SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠（WT mice）和 Nrlh4 knockout 小鼠（FXR-/-mice）各6只,给予APAP（300mg/kg）24h,观察小鼠生存率。SPF级雄性C57BL/6小鼠（WT mice）24只,随机分成4组,每组6只,分为正常组、模型组、OCA 组（20mg/kg）、SS 组（160mg/kg）。Nr1h4 knockout小鼠（FXR-/-mice）24只,随机分成4组,每组6只,分成正常组、模型组、OCA组（20mg/kg）、SS组（160mg/kg）。除正常组和模型组外,各组每天灌胃给药一次,共给药7天。于第7天禁食12h后,除正常组外其余各组给予APAP（300mg/kg）6h后,取样。对肝损伤指标ALT、AST、LDH进行检测,H&E病理组织染色、TUNEL实验进行病理分析,再运用qRT-PCR、western blot、免疫荧光、免疫组化、LC-MS/MS检测等实验手段对氧化应激、炎症、APAP代谢相关的指标和基因蛋白表达进行检测。4.SS对高脂饮食诱导NAFL损伤的保护作用及分子机制研究SPF级雄性C57BL/6小鼠72只,随机分成6组,每组12只,分为正常组、模型组、熊去氧胆酸（UDCA,60 mg/kg）、OCA组（20mg/kg）、SS低剂量组、高剂量组（80 mg/kg,160 mg/kg）。正常组每天喂养普通饲料,其余给予高脂饲料。自由饮水,各组每天灌胃给药一次。共给药4周。每隔7天称量小鼠体重。于第28天禁食12h后,取样。血清中甘油三酯（TG）,胆固醇（Ch）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）进行检测。对肝损伤指标ALT、AST进行检测,H&E病理组织染色进行肝组织病理分析;运用qRT-PCR、western blot、免疫双荧光对相关通路基因mRNA蛋白进行检测。运用油酸（oleic acid,OA）建立细胞脂质堆积模型,SS干预,检测细胞内TG含量,并运用油红和苏木素双染色评估脂质清除情况,并运用qRT-PCR、western blot检测脂质相关通路中mRNA和蛋白表达情况。结果:1.SS能够与FXR-LBD相互结合,并且激活FXR上调BSEP mRNA和蛋白表达,同时下调CYP7A1 mRNA和蛋白表达。沉默FXR后,SS不能有效的调控BSEP和CYP7A1 mRNA和蛋白表达,表明FXR对于SS调控下游靶基因的重要性。2.建立APAP诱导小鼠肝损伤模型,SS降低由于APAP诱导的AST、LDH含量的升高（p<0.01或0.05）,降低肝组织炎症浸润和坏死程度,有良好的肝功能恢复和肝损伤保护作用。GSH的耗竭是APAP代谢生成过多NAPQI导致肝损伤的最初起步,SS升高了 GSH和SOD含量和降低MDA、8-OHdG的含量（p<0.01或0.05）,增强Gclc和Gclm的表达,抑制JNK和P38的磷酸化,通过抗氧化能力保护APAP诱导的氧化应激性肝损伤。花生四烯酸代谢产生炎症介质是炎症反应的重要机制,SS调节APAP介导的花生四烯酸代谢炎症介质,抑制IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的产生及mRNA的表达（p<0.01或0.05）,抑制IL-6、CRP、F4/80+/CD11b+/CD45+在肝组织中的表达,抑制APAP诱导的NF-κB的核移位,通过介导肝组织中炎症反应保护APAP诱导的炎症性肝损伤。另外,SS可以激活FXR通路,增强或者增加Ⅱ相代谢酶和转运蛋白中BSEP、UGT1A1、SLC10a1、SLCO1a1、GSTA1和OSTβ的表达,而不是Ⅰ相酶代谢中CYP3A11和CYP2E1,改善APAP诱导的毒性肝损伤。体外实验中,APAP诱导小鼠原代肝细胞损伤模型,APAP诱导24h下导致细胞死亡率为70%,SS的干预提高细胞生存率。APAP诱导原代肝细胞导致肝损伤标志ALT和AST的显著上高（p<0.01）,SS有效降低了 AST含量的降低（p<0.01或p<0.05）。SS还可以降低DNA断裂片段,增加APAP诱导的线粒体膜电位下降,保护了 APAP诱导的小鼠原代肝细胞损伤和死亡。APAP诱导小鼠原代肝细胞显著消耗GSH而增加了 ROS产生,SS显著提高GSH的含量同时降低ROS的产生（p<0.01或p<0.05）。接下来,我们研究了 SS对肝细胞损伤保护机制。APAP诱导24h后增加了 JNK和P38蛋白磷酸化表达,激活了 MAPK通路,而SS干预则显著抑制了 JNK和P38磷酸化。SS通过降低细胞死亡和氧化应激来减轻APAP诱导的细胞毒性。另外,运用LPS建立细胞炎症模型,LPS诱导小鼠原代肝细胞增加IL-β、TNFα、IL-6、IL-10含量（p<0.01）,SS干预则减少了 IL-β、TNFα、IL-6的产生（p<0.01或p<0.05）,对IL-10没有显著影响。接下来,SS对NF-κB的表达影响研究,表明SS可以抑制LPS诱导的NF-κB的表达,并且抑制LPS诱导的NF-κB的核位移。SS能够抑制LPS诱导的NF-κB激活和核移位,减少炎症因子的产生,保护细胞的炎症损伤。3.在FXR-/-小鼠中建立APAP诱导的肝损伤模型,研究FXR在该模型保护作用中的角色。APAP 300mg/kg给予24h小鼠的生存率观察中,WT小鼠在24h内生存率是83.33%,然而FXR-/-小鼠12h内生存率只有16.67%,18h后全部死亡,说明FXR在APAP诱导小鼠肝损伤致死的保护作用中非常重要。APAP给与小鼠6h后,APAP诱导的AST、LDH含量的升高（p<0.01或0.05）,肝组织炎症浸润和坏死程度严重,在FXR-/-小鼠中,SS不能够缓解这现象,失去了肝功能恢复和肝损伤保护的作用。GSH的耗竭是APAP代谢生成过多NAPQI导致肝损伤的最初起步,APAP诱导GSH和SOD含量降低和MDA、8-OHdG含量的升高（p<0.01或0.05）,在FXR-/-小鼠中,SS不能逆转GSH和SOD的下降和MDA、8-OHdG含量的升高,也不能抑制JNK和P38的磷酸化。在FXR-/-小鼠中,SS失去了通过抗氧化能力保护APAP诱导的氧化应激性肝损伤的作用。花生四烯酸代谢产生炎症介质是炎症反应的重要机制,APAP介导花生四烯酸代谢炎症介质,增加IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的产生及mRNA的表达（p<0.01 或 0.05）,增加 IL-6、CRP、F4/80+/CD11b+/CD45+在肝组织中的表达,然而,在FXR-/-小鼠中,SS不能增加这些炎症因子的增加。另外,APAP诱导的NF-κB的核移位,在FXR-/-小鼠中,SS不能抑制NF-κB的核移位,失去通过介导肝组织中炎症反应保护APAP诱导的炎症性肝损伤的作用。另外,在FXR-/-小鼠中,SS不能激活FXR通路,失去对Ⅱ相代谢酶和转运蛋白中 BSEP、UGT1A1、SLC1Oa1、SLCO1a1、GSTA1 和 OSTβ 的表达的部分调控,不能通过Ⅱ相酶改善APAP诱导的毒性肝损伤。4.HFD建立小鼠NAFL模型,诱导小鼠血清中TG、Ch的升高,SS降低干预则降低TG、Ch的升高（p<0.01或0.05）。所以,SS降低了 HFD诱导的小鼠体内脂质含量的增高。HFD诱导显著升高血清中ALT和AST的含量（p<0.01或0.05）,增加了肝组织脂肪变性和炎症细胞浸润;SS干预后,显著降低血清中AST含量（p<0.01或0.05）,缓解了肝组织脂肪变性和炎症细胞浸润,保护了 HFD诱导的肝组织损伤。接下来,评估SS保护作用的机制,HFD使得小鼠肝组织中SREBP1 mRNA和蛋白表达降低,然而,SS干预后激活肝组织中FXR抑制SREPB1的表达,发挥改善HFD诱导的NAFL损伤。另外,OA建立Huh-7细胞脂质堆积模型,细胞内TG含量升高脂滴显著聚集。SS干预后,降低OA诱导的细胞内TG含量升高（p<0.01或0.05）,减轻OA诱导的Huh-7细胞脂滴堆积。并且SS激活FXR抑制SREPB1的表达,发挥降低细胞内脂质堆积的作用。结论:SS是FXR激动剂。SS可以通过降低APAP诱导的氧化应激,抑制JNK的活性和ROS释放;激活FXR抑制NF-κB的活性,减低炎症因子的产生而抑制过度炎症反应,为APAP诱导肝毒性治疗提供保护作用。另外,SS可以通过激活FXR信号通路,降低SREBP1的表达,回降HFD诱导的TG和Ch含量的升高,减轻代谢应激,降低肝脏损伤。