研究背景及目的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H pylori)感染作为一个明确的致癌因素已得到广泛公认,在Correa提出的由“慢性浅表性胃炎(CSG)-慢性萎缩性胃炎(CAG)-肠上皮化生(IM)-不典型增生(AH)-胃癌(GC)”被公认为人类胃癌,尤其是肠型胃癌发生的典型模式,H pylori被认为是这一发展过程的首要推动因子。胃癌是一种基因病,胃癌的发生发展是多种基因改变逐渐累积的结果,不同的基因可能在不同的阶段发挥作用。在这个复杂的多基因作用过程中,不仅与原癌基因的激活和抑癌基因的突变有关,还与细胞凋亡基因密切相关。在H pylori感染所致癌变过程中,凋亡相关基因在胃癌的发生发展过程中可能起到一个关键性的作用,但目前H pylori感染在胃癌发病中的确切作用及细胞凋亡调控机制及两者之间的相关性尚未阐明,特别是在凋亡调控机制中,凋亡诱导/抑制基因可能在不同阶段发挥不同作用,而它们与H pylori感染所致胃癌变过程中作用的双面性及可能机制更有待探索。Fas相关因子1 ( Fas-associated factor 1,FAF1)是新近发现的Fas死亡信号结合体的成员之一,其N-末端区域能与Fas特异性的结合,它是能够增强Fas介导细胞凋亡的蛋白分子,且在胃癌组织中有特异性低表达,关于FAF1的作用目前知道的尚少,在我们的前期研究中初步证实FAF1在胃癌组织中低表达,作为凋亡诱导因子,与H pylori感染所致胃癌变的相关性及作用机理尚无相关报道。B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/Leukemia-2,Bcl-2)基因是最早发现的细胞凋亡抑制基因,是迄今研究最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。业已证明Bcl-2是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因。生存素(Survivin)是IAP家族成员之一,是迄今发现最强的凋亡抑制因子,作用于各凋亡途径的汇集点。Survivin在正常成熟的人体组织中不表达或低表达,而在人类大多数肿瘤组织中均存在阳性高表达,提示它在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。关于H pylori感染与胃癌变过程中凋亡抑制基因Bcl-2与Survivin的表达作用机制目前研究也尚不多,且在这个过程中与FAF1如何共同发挥作用也有待探索。因此本研究旨在为阐明胃癌变过程中H pylori感染与这些凋亡调控相关基因FAF1、Bcl-2、Survivin的表达的相关性及可能作用机制,并进一步结合临床相关资料,探讨这些凋亡调控相关基因在胃癌的早期诊断、浸润转移以及预后判断中的作用,以便为胃癌的早期诊断和治疗提供具有参考价值的分子生物学指标。方法用快速尿素酶法、W-S银染法和美蓝法联合检测62例慢性浅表性胃炎(CSG)、55例慢性萎缩性胃炎(CAG)、52例肠化生(IM)、46例不典型增生(AH)、65例胃癌(GC)组织中H pylori的感染,并采用免疫组化分别检测标本中凋亡调控相关基因FAF1、Bcl-2、Survivin蛋白的表达,脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)检查细胞凋亡水平,分析H pylori感染在胃癌变过程中与FAF1、Bcl-2、Survivin蛋白的表达相关性及与细胞凋亡的关系;进一步采用荧光定量法检测标本中FAF1 mRNA、Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA的表达水平,探讨H pylori感染对FAF1、Bcl-2、Survivin基因水平调控的影响;并结合临床病例的病理学特征及随访资料,探讨凋亡调控相关基因FAF1、Bcl-2和Survivin在胃癌的早期诊断、浸润转移以及预后判断中的作用。结果第一部分:1. GC形成中的H pylori感染率本组280例病例中,三种方法联合检测H pylori感染率为53.6%,H pylori感染在CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中随着病变恶性程度的增加而感染率增加,分别为30.6%,49.1%,55.8%,65.2%,69.2%。H pylori感染率CAG、IM、AH和AC组较CSG组均明显升高(p<0.05);GC组H pylori感染率较CAG组升高(p<0.05)。2. GC形成过程中的FAF1、Bcl-2和Survivin蛋白表达及与细胞凋亡的关系在CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中,FAF1的阳性表达率随病变程度加重而逐渐降低,分别为72.6%,65.5%,63.8%,54.3%,36.8%,AH组较CSG阳性率降低(p<0.05),GC组较CSG、CAG、IM组明显降低(p<0.01);Bcl-2的阳性表达率随病变程度加重而逐渐升高,分别为16.1%,21.8%,32.7%,50.0%,61.5%,其中IM组较CSG组阳性率升高(p<0.05);AH、GC组较CSG、CAG组阳性率明显升高(p<0.01);Survivin蛋白在CSG组织中未见表达,在非癌性病变组织中表达程度较弱,在胃癌组织中表达程度较高,分别为0,9.1%,17.3%,45.7%,63.1%,AH、GC组较CSG、CAG、IM组阳性率明显升高(p<0.01)。细胞凋亡指数(AI)在CSG、CAG阶段逐渐升高,在AH、GC阶段逐渐降低,CAG、IM组较CSG组AI明显升高(p<0.01);AH、GC组较CSG、CAG、IM组AI明显降低(p<0.01)。在CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中,FAF1阳性表达者凋亡指数均高于FAF1阴性,且各组均具有统计学意义(p<0.05,p<0.01);CAG、IM、AH、GC组Bcl-2阳性表达者凋亡指数均低于Bcl-2阴性,且在IM、AH及GC组具有统计学意义(p<0.05,p<0.01);CAG、IM、AH、GC组Survivin阳性表达者凋亡指数均低于Survivin阴性,且具有统计学意义(p<0.05)。在CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中,FAF1的表达与病变恶性程度呈负相关(r=-0.251,p<0.05),Bcl-2、Survivin的表达与病变恶性程度呈正相关(r=0.361,0.535,p均<0.01)。FAF1阳性率与Bcl-2和Survivin阳性率呈负相关(r=-0.958、-0.971,p均<0.05),Bcl-2阳性率与Survivin阳性率呈正相关(r=0.995,p<0.01)。FAF1的阳性率与凋亡指数呈正相关趋势(r=0.738,p>0.05),Bcl-2和Survivin的阳性率与凋亡指数呈负相关趋势(r=-0.748、-0.782,p均>0.05)。3. GC形成过程中H pylori感染与细胞凋亡的关系在CSG组,H pylori阳性AI高于H pylori阴性,差异有统计学意义(t’ =2.055,p<0.05),而在GC组,H pylori阳性AI低于H pylori阴性,差异有统计学意义(t’ =2.817,p<0.05),在其余三组之间差别无统计学意义(p>0.05)。4. GC形成过程中H pylori感染对FAF1、Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响H pylori阳性AH、GC组FAF1阳性表达率低于H pylori阴性组,且在GC组具有统计学意义(p<0.05),CSG、CAG和IM组H pylori阳性者FAF1阳性表达率略高于H pylori阴性组,但无统计学意义(p>0.05)。H pylori阳性CSG、CAG、IM、AH、GC组Bcl-2表达阳性率均高于H pylori阴性组,且在GC组具有统计学意义(p<0.05)。H pylori阳性CAG、IM、AH、GC组Survivin表达阳性率均高于H pylori阴性组,且在AH、GC组具有统计学意义(p<0.05)。第二部分:1. GC形成过程中FAF1、Bcl-2和Survivin mRNA的表达水平FAF1mRNA在不同胃黏膜病变组织中均能检测到表达,在GC组mRNA相对表达量较低。Bcl-2mRNA在CSG→CAG→IM→AH→GC中阳性表达率分别为22.6%(14/62),30.9%(17/55),40.4%(21/52),58.7%(27/46),69.2%(45/65)。SurvivinmRNA阳性表达率分别为0,12.7%(7/55),25.0%(13/52),54.3%(25/46),75.4%(49/65)。FAF1mRNA在CSG→CAG→IM→AH→GC表达水平分别为0.136±0.008,0.131±0.009,0.128±0.010,0.094±0.032,0.006±0.003;Bcl-2mRNA表达水平分别为0.095±0.015,0.115±0.012,0.173±0.027,0.224±0.042,0.368±0.036;Survivin mRNA表达水平分别为0,0.068±0.007,0.347±0.060,0.553±0.080,1.646±0.356。可以看到,随着恶变程度的进展,FAF1mRNA的表达量逐渐下降,而Bcl-2和SurvivinmRNA表达阳性率和表达量逐渐上升。三个基因在IM阶段开始有表达差异,在GC组差异最为显著,AH组次之。2. GC形成过程中FAF1、Bcl-2和Survivin mRNA表达的相关性分析经Spearman Correlations等级相关检验,在CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中,FAF1mRNA的表达与病变恶性程度呈负相关(r=-0.827,p<0.01),Bcl-2、Survivin mRNA表达与病变恶性程度呈正相关(r分别0.945,0.918,p均<0.01)。经Bivariate Correlations分析,CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中,FAF1mRNA表达量与Bcl-2和SurvivinmRNA表达量呈负相关(r分别为-0.911、-0.890,p均<0.01),Bcl-2 mRNA表达量与SurvivinmRNA表达量正相关(r=0.906,p<0.01)。3. GC形成过程中FAF1、Bcl-2和Survivin三者基因表达和蛋白表达的相关性分析经Bivariate Correlations分析,在CSG→CAG→IM→AH→GC发展过程中,FAF1基因与蛋白表达呈正相关(r=0.298,p<0.01),Bcl-2基因与蛋白表达呈正相关(r=0.324,p<0.01),Survivin基因与蛋白表达呈正相关(r=0.403,p<0.01),均具有一致性。4. GC形成过程中FAF1、Bcl-2和Survivin mRNA的表达与H pylori感染状况之间的关系在CSG和CAG组中,H pylori阳性者FAF1mRNA的表达略高于H pylori阴性,在IM组始这种趋势发生改变,在AH、GC组H pylori阳性FAF1mRNA的表达均明显低于H pylori阴性,差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01);Bcl-2 mRNA的表达在IM、AH、GC组H pylori阳性均明显高于H pylori阴性,差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01);Survivin mRNA的表达在AH、GC组H pylori阳性均明显高于H pylori阴性,差异有统计学意义(p<0.05)。随着胃黏膜恶变程度的加重,H pylori感染对FAF1mRNA的表达起下调作用,而对Bcl-2mRNA和SurvivinmRNA的表达起上调作用。第三部分:1. FAF1、Bcl-2和Survivin蛋白表达与胃癌各临床病理特征的相关性相关性分析显示,FAF1表达与胃癌患者肿瘤大小、病理组织学分级、肿瘤的浸润程度、有无淋巴结转移、有无远处转移、TNM临床分期密切相关(p<0.01)。Bcl-2表达与肿瘤的浸润程度、有无淋巴结转移、TNM临床分期密切相关(p<0.01)。Survivin表达与组织学分级、肿瘤的浸润程度、TNM临床分期密切相关(p<0.05, p<0.01)。同时,相关性分析显示:胃癌中FAF1表达与Bcl-2和Survivin表达呈负相关(r_s=-0.236,r_s=-0.293,p均<0.01),Bcl-2和Survivin表达呈正相关(r_s=0.210,p<0.05)。2. FAF1、Bcl-2和Survivin表达和临床病理学特征的预后分析经单因素分析显示,FAF1、Bcl-2和Survivin的表达、肿瘤的大小、发生部位、肿瘤浸润深度、组织学分级、有无淋巴结转移、有无远处转移、TNM临床分期状况均是影响生存的预后因素,其中FAF1的表达为保护性因素,其它均为危险性因素。多因素分析显示FAF1、Bcl-2和Survivin的表达均不能成为影响患者总生存的独立预后因素。3. FAF1、Bcl-2和Survivin表达对胃癌根治术患者术后生存的影响随着FAF1表达程度的增加,中位生存时间延长,而随着Bcl-2和Survivin表达程度的增加,中位生存时间缩短。FAF1三组比较,1年、3年和5年生存率比较均有显著性差异(χ~2=1.029,χ~2=2.302,χ~2=6.218,p均<0.01);Bcl-2四组比较,1年生存率未见差异(χ~2=2.201,p=0.532),3年和5年生存率比较均有显著性差异(χ~2=13.102,χ~2=3.017,p均<0.01);Survivin四组比较,1年、3年和5年生存率比较均有显著性差异(χ2= 36.463,χ2=43.787,χ2= 8.646,p均<0.01)。Log-Rank法生存曲线配对比较,FAF1三组之间均有显著差异(p<0.01,p<0.05),Bcl-2组除“-”与“+”外,其余各组之间均有显著性意义(p<0.01, p<0.05)。Survivin组除“-”与“+”、“+”与“++”外,其余各组之间均有显著性意义(p<0.01,p<0.05)。结论1.从蛋白水平和细胞水平分析FAF1、Bcl-2和Survivin三个凋亡相关基因在胃黏膜癌变(CSG→CAG→IM→AH→GC)过程中的变化规律,显示了FAF1表达水平逐渐降低,Bcl-2和Survivin表达水平逐渐升高,相应的由FAF1介导和调控的胃黏膜细胞凋亡诱导作用逐渐减弱,而Bcl-2和Survivin介导的凋亡抑制作用逐渐增强,尤其发展到AH阶段后凋亡过程受到明显阻遏,凋亡指数(AI)明显降低,凋亡失衡而导致了胃癌的发生。2.从基因水平和蛋白水平研究在胃黏膜癌变过程中的H pylori感染对FAF1、Bcl-2和Survivin的调控作用,显示了H pylori感染下调FAF1mRNA的表达, FAF1蛋白表达水平降低,而上调Bcl-2和SurvivinmRNA的表达, Bcl-2和Survivin蛋白表达水平增高,提示了H pylori感染引起FAF1、Bcl-2和Survivin基因调控失衡可能是胃癌变的机制之一。3.临床分析显示,FAF1、Bcl-2和Survivin的表达与胃癌的生物学行为及临床病理特征密切相关,对胃癌患者预后有重要影响。FAF1高表达者,中位生存时间延长,生存率提高。Bcl-2和Survivin高表达者,中位生存时间缩短,生存率下降。