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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状为主要临床特征的慢性进行性中枢神经系统变性疾病,是最常见的老年期痴呆。该病发病机制复杂,难以单一机制概括,且尚无有效的治疗方法。目前关于发病机制较为公认的假说包括:β-淀粉样蛋白瀑布假说、tau蛋白假说、氧化应激假说、炎性机制假说、基因突变及线粒体功能障碍假说等。最近研究证实,线粒体损伤诱发的细胞凋亡参与了阿尔茨海默病的发病过程,在AD早期即可因线粒体自噬异常导致线粒体功能障碍,使ATP合成减少,AMPK等下游通路被激活并继续进一步抑制能量代谢,形成恶性循环,最终导致神经元丢失。因此,受损线粒体的及时清除是非常重要的。线粒体自噬是通过选择性识别、降解受损并存在功能障碍的线粒体,防止其进一步损伤细胞,激活细胞凋亡的过程。其中,PINK1/Parkin调节的线粒体自噬,是当前研究的焦点。丁苯酞（Dl-3-n-butylphthalide,NBP）是临床中神经内科常用药物,具有改善线粒体功能、抗氧化应激、抑制凋亡、促进神经元再生等多种神经保护作用。已有研究证实NBP可改善AD患者认知障碍症状,但具体作用机制不明。本研究以AD细胞和动物模型为研究对象,给予丁苯酞干预,通过对AD病理经典指标、PINK1/Parkin通道相关蛋白、自噬水平及线粒体形态结构等的检测与观察,对如下研究内容进行验证:1)丁苯酞可通过PINK1/Parkin通路促进线粒体自噬发挥抗AD作用;2)Parkin是丁苯酞通过调控线粒体自噬机制发挥抗AD作用的关键效应因子;3)丁苯酞通过干扰去泛素化酶USP30的表达提高Parkin的泛素化活性促进自噬。方法:1.实验动物共分为5组:C57BL/6J小鼠作为正常组,APP/PS1作为AD模型小鼠分为4组（6月龄代表AD疾病中期、12月龄代表AD疾病晚期）:AD组（6月龄）、AD组（12月龄）、NBP组（6月龄）、NBP组（12月龄）。NBP组小鼠予以0.25mg/ml丁苯酞氯化钠注射液0.2ml/10g腹腔注射日2次,AD组与正常组予以氯化钠注射液0.2ml/10g腹腔注射日2次,共注射8周。2.8周后,用Morris水迷宫实验系统及视频分析系统评价各组小鼠学习记忆能力的改变:检测过程共7天,第1天没有平台为小鼠的适应期,第2-6天为小鼠的学习期,第7天为小鼠的空间探索期,以潜伏期、目标象限所在时间、穿越平台次数等指标来评定小鼠的学习和记忆能力。所得到的数据使用方差分析和LSD的事后分析方法。3.各组小鼠行水迷宫实验后进行海马组织取材:（1）Western blot检测PINK1/Parkin通道相关蛋白Parkin、USP30,自噬相关蛋白LC3B、P62,以及AD病理指标APP-C、Aβ、tau、P-tau的表达,明确NBP对不同病程AD中PINK1/Parkin通道及线粒体自噬水平调控情况及对AD病变的改善情况;（2）透射电镜观察海马神经元线粒体及自噬小体形态结构变化——检测线粒体自噬水平金标准;（3）免疫组化检测海马脑组织中老年斑沉积及自噬指标表达情况,评估丁苯酞对不同AD病程的改善情况。4.体外培养SH-SY5Y细胞,用不同浓度的Aβ25-35（10,20,40,80μM）处理,应用CCK8法测定细胞的生存率,建立AD细胞模型。同理应用CCK8法测定NBP（5,10,20,40,80,160μM）药物作用最适浓度。5.将细胞分为3组:正常组、AD组、NBP组。检测比较各组间细胞:（1）Western blot检测:PINK1/Parkin通道相关蛋白Parkin、USP30以及自噬相关蛋白LC3B、P62的表达,以明确丁苯酞对该线粒体自噬通道的调控作用;（2）Western blot检测:AD病理指标:APP-C、Aβ、tau、P-tau表达水平的变化,以明确丁苯酞对AD病理性损伤的修复作用;（3）流式细胞仪检测细胞凋亡情况;（4）透射电镜观察:线粒体形态结构变化及自噬体形成情况,是评价线粒体自噬金标准;（5）JC-1检测:线粒体膜电位变化,明确线粒体损伤情况。结果:1.NBP组较AD组小鼠学习记忆能力改善:学习能力方面,AD组小鼠的逃避潜伏期长于正常组,且随月龄增加,差异愈大,而NBP组小鼠逃避潜伏期较AD组缩短。记忆能力方面,AD组小鼠在目标象限停留时间及穿越平台次数比正常组小鼠显著下降,变化随月龄增加愈发明显,NBP组小鼠较AD组小鼠在目标象限停留时间及穿越平台次数上升。提示NBP可改善AD小鼠学习记忆情况。2.NBP组较AD组小鼠海马组织PINK1/Parkin通路蛋白和自噬标记物升高:Western blot结果提示,与相应月龄AD组小鼠相比,6月及12月龄NBP组小鼠海马组织中自噬相关蛋白LC3-11/LC3-1表达增加、P62表达减少,Parkin含量增加,USP30、APP-C、Aβ、tau、P-tau含量减少。且上述改变随月龄变化明显。提示在NBP动物模型中,通过PINKl/Parkin途径介导的线粒体自噬是增强的,并对AD的病理损伤具有一定修复作用,其中Parkin可能为NBP作用的关键效应因子。3.NBP组较AD组小鼠海马组织神经元线粒体形态结构完整、自噬体形成增多:电镜下观察各组小鼠神经元超微结构,可见正常组神经元线粒体双层膜结构完整、线粒体嵴清晰,细胞核膜结构完整、平滑,双层膜结构清晰,核内染色质均匀。NBP组神经元线粒体大多结构完整,部分线粒体轻微肿胀,可见线粒体嵴排列紊乱,细胞核膜结构较规则,核内染色质欠均匀,视野内可见多个自噬体。AD组神经元结构异常的线粒体进一步增多,表现为双层膜结构溶解,内嵴破坏,12月龄AD小鼠海马内有大量退化的线粒体固缩、基质变深,在轴突中堆积形成髓样小体。提示在AD动物模型中线粒体及细胞核形态结构被破坏、自噬减少,NBP可起到维持保护线粒体及细胞核形态结构、促进自噬的作用。4.NBP组较AD组小鼠海马区Aβ沉积减少,自噬标记物LC3B表达上调,神经元细胞形态完整:HE染色各组海马CAl区变化:正常组神经元排列整齐,形态圆形较规整,数量正常,胞浆均匀红染,核大而圆呈淡蓝色,核膜边界清晰。AD组神经元排列紊乱,数量显著降低,胞浆皱缩空泡形成,胞核固缩呈蓝紫色。丁苯酞组可见大量神经元存活,边界尚清,形态较规整,胞核形状较规则边界清晰,少数细胞出现核染色加深,胞浆部分消失等变性表现。免疫组织化学染色各组海马CAl区变化:与正常组相比,AD组小鼠12月龄时Aβ阳性染色细胞比率显著增加、LC3B阳性染色细胞比率下降,6月龄时与正常组相比无统计学差异。NBP组较同龄AD组小鼠Aβ阳性染色细胞减少,LC3B阳性染色细胞比率增多。5.CCK8法检测细胞活力显示Aβ25-35浓度为≤20umol/L时,作用细胞24 h,细胞活性无显著变化。NBP浓度为≤40umol/L时,细胞活力无显著变化,不具有细胞毒性。6.NBP组较AD组细胞PINK1/Parkin通路蛋白和自噬标记物升高,AD病理指标降低:Western blot结果提示,与AD组相比NBP组SH-SY5Y细胞中自噬相关蛋白LC3-11/LC3-1表达增加、P62表达减少,Parkin含量增加,USP30、APP-C、Aβ、tau、P-tau含量减少。提示在NBP细胞模型中,通过PINKl/Parkin途径介导的线粒体自噬是增强的,并对AD的病理损伤具有一定修复作用。7.NBP组较AD组SH-SY5Y神经元细胞中线粒体形态结构更为完整、自噬体形成增多:电镜下观察各组神经元细胞超微结构,可见正常组神经元线粒体双层膜结构完整、线粒体嵴清晰,细胞核膜结构完整、平滑,双层膜结构清晰,核内染色质均匀。AD组神经元结构异常的线粒体明显增多,表现为双层膜结构溶解,内嵴破坏,细胞内可见大量退化的线粒体固缩、基质变深,堆积形成髓样小体。NBP组神经元线粒体大多结构完整,部分线粒体轻微肿胀,可见线粒体嵴排列紊乱,细胞核膜结构较规则,核内染色质欠均匀,视野内可见多个自噬体。提示在AD细胞模型中线粒体及细胞核形态结构被破坏、自噬减少,NBP可起到维持保护线粒体及细胞核形态结构、促进自噬的作用。8.NBP组细胞凋亡率较AD组降低:应用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞进行AD细胞造模后,AD组细胞凋亡率较正常组显著升高,NBP组较AD组降低。9.JC-1检测发现NBP可改善AD组细胞线粒体损伤情况:比较各组细胞间Δψm的变化,Δψm较高时,JC-1聚集形成聚合物,产生红色荧光,否则产生绿色荧光,AD组细胞红色荧光明显降低,绿色荧光明显增加,红色荧光向绿色荧光转变明显,予NBP预处理后红色荧光向绿色荧光转变的趋势被抑制。结论:丁苯酞可通过促进Parkin及干扰去泛素化酶USP30的表达提高Parkin的泛素化活性促进线粒体自噬,发挥改善AD动物模型认知障碍症状、减少Aβ沉积及tau蛋白异常磷酸化、抑制线粒体损伤、减少细胞凋亡、维持神经元正常超微结构的神经保护作用。其中Parkin是丁苯酞调控线粒体自噬的关键效应因子,可作为研究AD早期预防及减缓病程进展的新靶点。