花椒(Z.bungeanum maxim)是我国及世界上部分国家重要的、较为广泛食用的天然香辛料和中药配料,其有效成分为花椒呈香和呈味成分。其中,花椒的呈味成分为花椒麻味物质,也称为花椒麻素,是一类存在于花椒中结构独特的重要活性成分(酰胺类物质),具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎止痛以及抗血小板凝集等多种生理活性。近年来的研究表明,花椒麻素可促进体内脂肪的氧化,减少脂肪沉积和血清中甘油三酯浓度的作用;另外,花椒麻素还可通过抑制糖异生作用,减少肝糖的输出,并能修复胰岛功能,促进胰岛素的分泌来改善链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱异的糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱。虽然花椒麻素对人体的功能作用已有一定的研究,但仍存在较多不明确的问题,尤其是对体内蛋白质合成与分解代谢方面的作用等方面研究甚少。现有研究表明,蛋白质合成代谢及分解代谢作用都依赖于mTOR途径,这意味着mTOR可能作为蛋白质合成与分解过程的交叉位点,通过对下游分子的表达调控,起到调控蛋白质代谢的作用。而mTOR的活化受上游多个信号通路(受营养因子、生长因子、能量)所介导,其中腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)可负向调控mTOR。泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin–proteasome pathway,UPP)通过三酶级联反应将泛素连接于靶蛋白使其泛素化,介导了真核生物80%-85%的蛋白降解。然而花椒麻素对机体蛋白质合成和分解代谢的影响如何?以何种刺激信号(营养因子、生长因子、能量等)去影响?等均不清楚。因此,本实验运用大鼠动物在体实验,采用qPCR和western-blot等技术从核酸水平和蛋白水平探明花椒麻素对不同体质(健康、糖尿病-Ⅰ型)大鼠个体的机体内蛋白质合成代谢的mTOR途径、AMPK途径和分解代谢的UPP途径的影响,最终明确花椒麻素对机体内蛋白质合成与分解代谢的影响及机制,并建立起一套研究生物活性物质对蛋白质代谢影响分子机制的技术与方法体系。其主要研究结果如下:(1)花椒麻素对健康SD试验大鼠机体蛋白质代谢的影响研究将32只健康SD雄性大鼠按体重随机分为空白对照组(Control),花椒麻素的大豆油溶液高剂量灌胃试验组8mg/(kg.d)(HDG)、中剂量灌胃试验组4mg/(kg.d)(MDG)和低剂量灌胃试验组2mg/(kg.d)(LDG),每组各8只,试验期为28天。实验结束后,测定试验大鼠血清、肝脏、骨骼肌和空肠等组织中与机体蛋白质代谢直接相关的生理生化指标、代谢酶的活性和激素的水平等的变化;qPCR检测其骨骼肌中肌细胞生成素(myogenin,My OG)、肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)、钙蛋白酶-1(μ-calpain,CAPN-1)、钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin,CAST)的mRNA的转录水平,以探讨花椒麻素对健康SD试验大鼠机体蛋白质代谢的影响。实验结果表明,与空白对照组相比,花椒麻素可显著(p<0.05)提高大鼠相对骨骼肌的重量,可显著(p<0.05)降低腹脂率,但对其它脏器的相对重量影响不显著(P>0.05);显著(p<0.05)增加试验大鼠血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白的含量,但对白蛋白/球蛋白比值的影响不显著(P>0.05);显著(p<0.05)降低试验大鼠血尿氮(BUN)的含量,但对大鼠血清Cr含量的影响不显著(P>0.05);显著(p<0.05)升高血清中三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-I)的含量,但对血清中甲状腺素(thyroxine,T4),白细胞介素6(interleukin,IL-6)和胰岛素(insulin,Ins)的影响不显著(P>0.05);中、高剂量试验组的花椒麻素可显著(p<0.05)提高大鼠空肠刷状缘γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyltransferase,γ-GT)活性和空肠氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)活性(p<0.05),但对空肠羧肽酶A(Carboxypeptidase,CPA)和二肽基肽酶-Ⅳ(dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)活性的影响不显著(P>0.05);显著(p<0.05)升高试验大鼠骨骼肌中RNA的含量(p<0.05),而对大鼠骨骼肌中DNA含量无显著影响(P>0.05),高剂量试验组和中剂量试验组显著(p<0.05)提高骨骼肌中RNA/DNA比值。此外,花椒麻素可显著(p<0.05)上调大鼠骨骼肌中IGF-Ⅰ、My OG、CAPN-1和CAST mRNA表达量,显著(p<0.05)下调MSTN mRNA表达量。结果提示:灌胃适当剂量的花椒麻素可显著增加试验大鼠的相对骨骼肌重,减少腹脂的沉积;显著降低体重;说明花椒麻可通过调节能量分配来改变试验大鼠胴体的组成。适当剂量的花椒麻素可显著提高试验大鼠血清总蛋白的含量,显著增强肝脏中GPT的活性,促进机体蛋质的合成代谢。另外,花椒麻素可通过上调My OG mRNA表达量的同时下调抑制基因MSTN mRNA表达量,促进骨骼肌的生长;可由CAPN-1/CAST系统增强骨骼肌蛋白质的更新,并促进蛋白质的沉积。其中,高剂量试验组和中剂量试验组促进机体蛋白质沉积的效果比低剂量试验组显著(p<0.05)。(2)花椒麻素对健康SD试验大鼠氨基酸及氨基酸转运载体影响的研究实验设计同(1)。实验结束后,测定试验大鼠血清、肝脏、骨骼肌及空肠中15种氨基酸的含量;应用qPCR检测空肠、骨骼肌、肝脏中相应氨基酸转运载体的mRNA的转录水平,以探讨氨基酸及氨基酸转运载体是否为花椒麻素对健康SD试验大鼠蛋白质沉积的信号因子。实验结果表明,与空白对照组相比,花椒麻素可显著(p<0.05)升高试验大鼠血清和骨骼肌中Asp、Glu、Asn、Arg、Ser和Ala含量;显著(p<0.05)降低试验大鼠血清中Gln含量;显著(p<0.05)增加骨骼肌和空肠组织中Gln含量;肝脏中Gln含量有增加趋势,但不显著(P>0.05)。花椒麻素对试验大鼠骨骼肌中BCAA的影响主要表现为降低其含量,其中高剂量试验组和中剂量试验组可显著(p<0.05)降低骨骼肌Ile的含量(p<0.05)。花椒麻素可显著(p<0.05)上调试验大鼠空肠Pep T1、ECAA1、ASCT1和PAT1 mRNA表达量;显著(p<0.05)下调试验大鼠空肠CAT-1、y+LAT1、b0,+AT mRNA表达量,但对ATB0,+的影响不显著(P>0.05)。显著(p<0.05)上调试验大鼠肝脏Pep T1、ASCT1和ECAA1 mRNA表达量;显著(p<0.05)上调骨骼肌PAT1 mRNA表达量,显著(p<0.05)下调ATF4、CD98和y+LAT1 mRNA表达量。结果提示:花椒麻素升高试验大鼠血清和骨骼肌中的生糖氨基酸,其主要来源于机体内相应α-酮酸自身合成导致。其中,高剂量试验组和中剂量试验组升高试验大鼠血清和骨骼肌中生糖氨基酸效果显著高于低剂量试验组(p<0.05)。综合以上结果可知,氨基酸和氨基酸转运载体并非花椒麻素影响试验大鼠蛋白质沉积的信号因子。(3)花椒麻素对健康SD试验大鼠蛋白质合成与分解代谢影响的机制研究实验设计同(1)。实验结束后,采用实时荧光定量及其蛋白免疫印迹技术检测试验大鼠肝脏及骨骼肌中与蛋白质合成与分解代谢的相关基因mRNA及其蛋白表达量,以进一步探讨花椒麻素对健康SD试验大鼠蛋白质合成与分解代谢影响的机制。实验结果表明,与空白对照组相比,花椒麻素可显著(P<0.05)上调试验大鼠肝脏中IGF-I、mTOR、PI3K和PKB mRNA表达量,显著(P<0.05)上调试验大鼠肝脏的mTOR,p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB和p-PKB(Ser437)蛋白水平;显著(P<0.05)上调试验大鼠骨骼肌IGF-I、mTOR、PI3K、PKB、TSC2 mRNA的表达量,显著(P<0.05)上调试验大鼠骨骼肌mTOR,p-mTOR(Ser2448)、PI3K(p110)、PKB、p-PKB(Ser437)和TSC2蛋白水平,而对AMPK、p-AMPK(Thr 172)和TSC1蛋白水平影响不显著(P>0.05)。另外,灌胃花椒麻素可显著(P<0.05)下调试验大鼠骨骼肌atrogin-1/MAFbx、Mu RF1、Fox O1、Fox O3和Fox O4 mRNA的表达量和蛋白水平。结果提示:花椒麻素对健康SD试验大鼠骨骼肌中AMPK途径的影响不显著(P>0.05);可通过IGF-I→PI3K→PKB→mTOR途径增加机体蛋白质合成,并通过UPP途径减少蛋白质的分解。(4)花椒麻素对STZ诱导的糖尿病试验大鼠蛋白质代谢的影响和机制研究以40只雄性糖尿病试验大鼠为研究对象,并随机分为空白对照组(Control),模型对照组(DM),高剂量灌胃8mg/(kg.d)(DM-HD)试验组、中剂量灌胃4mg/(kg.d)(DM-MD)试验组和低剂量灌胃2mg/(kg.d)(DM-LD)试验组,每组各8只,连续灌胃28 d。实验结束后,测定糖尿病试验大鼠血清、肝脏、骨骼肌和空肠等组织中与机体蛋白质代谢直接相关的生理生化指标、代谢酶的酶活和激素水平等的含量与变化;并采用qPCR和western-blot等技术检测大鼠肝脏及骨骼肌中与蛋白质合成与分解代谢相关基因mRNA及蛋白表达量,来探讨花椒麻素对蛋白质代谢紊乱的糖尿病试验大鼠的蛋白质代谢影响与机制,以进一步阐明花椒麻素对试验大鼠蛋白质代谢的影响与机制。实验结果表明,花椒麻素可显著(P<0.05)降低糖尿病试验大鼠空腹血糖和果糖胺的含量,可缓解因糖尿病诱导的脏器肿大;显著(P<0.05)增加骨骼肌重量,显著(P<0.05)升高血清胰岛素、IGF-I、总蛋白、白蛋白含量及球蛋白/白蛋白比值。显著(P<0.05)增加骨骼肌总蛋白、RNA含量及RNA/DNA比值;可显著(P<0.05)上调肝脏和骨骼肌IGF-I,IGF-IR和In R mRNA表达量;显著(P<0.05)上调骨骼肌PI3K、PKB和mTOR mRNA表达量;显著(P<0.05)下调骨骼肌atrogin-1/MAFbx、MURF1和Fox O mRNA表达量;显著(P<0.05)上调骨骼肌mTOR(total)、p-mTOR(ser2448、PKB(total)、p-PKB(ser437)和PI3K(p110)蛋白水平;显著(P<0.05)下调骨骼肌中atrogin-1/MAFbx、MURF1和Fox O蛋白表达量。结果提示:花椒麻素可改善因STZ诱导所致糖尿病大鼠机体内蛋白质代谢紊乱,其中高剂量试验组和中剂量试验组改善糖尿病大鼠机体内蛋白质代谢紊乱的效果显著(P<0.05)好于低剂量试验组。其机制可能为:花椒麻素可由Ins/IGF-I→PI3K→PKB→mTOR信号通路增加糖尿病试验大鼠蛋白质合成,并通过UPP途径降低蛋白质的分解。(5)花椒麻素对糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途径的影响研究实验设计同(4)。实验结束后,测定糖尿病试验大鼠血清和肝脏中TG(triglyceride)、MDA(malondialdehyde)、TC(total cholesterol)和FFA(free fatty acid)含量及变化;并采用qPCR和western-blot检测糖尿病试验大鼠骨骼肌中AMPK、SIRT1、ACC、GLUT4等相关基因mRNA及蛋白表达量,以探讨花椒麻素对糖尿病大鼠骨骼肌AMPK途径的影响及潜在机制。实验结果表明,花椒麻素可显著(P<0.05)降低糖尿病试验大鼠血清中TG、MDA和FFA含量,显著(P<0.05)降低肝脏的TC、TG和MDA的含量。qPCR和western-blot检测表明,花椒麻素对糖尿病试验大鼠骨骼肌AMPK mRNA有上调趋势,但不显著(P>0.05);但显著(P<0.05)上调AMPK和p-AMPK(Thr172)蛋白质表达,显著(P<0.05)上调ACC mRNA表达和p-ACC(Ser79)蛋白质表达,同时显著(P<0.05)上调糖尿病大鼠骨骼肌细胞膜上GLUT4 mRNA和蛋白表达。结果提示:花椒麻素可激活糖尿病大鼠骨骼肌AMPK信号通路,抑制ACC活性减少脂肪酸的形成;同时通过激活AMPK信号通路介导GLUT4快速转位,提高葡萄糖转运速率,降低血糖。因此,花椒麻素可通过激活AMPK途径,改善糖尿病大鼠糖、脂及蛋白质代谢紊乱。花椒麻素对糖尿病大鼠骨骼肌蛋白质合成增加是Ins/IGF-I→PI3K→PKB途径和AMPK途径的综合结果,而且Ins/IGF-I→PI3K→PKB途径占主导地位。综上所述,花椒麻素对不同体质(健康、糖尿病-Ⅰ型)大鼠个体的机体内蛋白质合成的影响及机制存在差异。对健康大鼠的影响主要是增加相对骨骼重量、降低腹脂率;增加血清和组织IGF-I含量(P<0.05),而对Ins的影响不显著(P>0.05);促进机体内相应α-酮酸的合成;并以IGF-I→PI3K→PKB信号途径激活mTOR,而对氨基酸/氨基酸转运载体的信号途径和AMPK途径的影响不显著(P>0.05)。对糖尿病大鼠的影响主要是增加相对骨骼重量;不仅显著(P<0.05)增加血清Ins含量,而且血清和组织中IGF-I含量同样显著(P<0.05)增加;可激活AMPK途径;糖尿病大鼠骨骼肌蛋白质合成增强是mTOR途径和AMPK途径的综合结果,而且Ins/IGF-I→PI3K→PKB途径占主导地位。虽然花椒麻素对不同体质(健康试验SD大鼠,糖尿病试验大鼠)蛋白质合成的信号途径均为PI3K→PKB→mTOR。但两者又存在差异,在健康SD大鼠体内,花椒麻素激活PI3K→PKB→mTOR途径的信号因子为IGF-I;而在糖尿病试验大鼠机体内,花椒麻素激活这一信号途径信号因子是Ins和IGF-I共同作用结果。结合相关文献可知,花椒麻素对健康SD试验大鼠主要体现为促进蛋白质合成;花椒麻素对糖尿病试验大鼠不仅促进蛋白质合成,而且对机制蛋白质分解具有抑制作用。通过以上研究,本文的创新点如下:(1)通过动物实验证实了花椒麻素可通过IGF-I→PI3K→PKB→mTOR途径增加健康SD大鼠骨骼肌蛋白质合成。(2)通过动物实验证实了花椒麻素可激活糖尿病大鼠骨骼肌mTOR上游的Ins/IGF-I→PI3K→PKB途径和AMPK途径,并通过UPP途径降低糖尿病大鼠骨骼肌蛋白质分解,机体蛋白质的增加是合成与分解的最终结果。