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放射治疗是目前肿瘤治疗的重要手段之一,但治疗后肿瘤转移灶的形成却严重影响着放疗的效果。放疗是否能够直接导致肿瘤细胞发生转移目前尚无定论,因此针对肿瘤转移的某个关键环节作为靶点探讨电离辐射(ionizing radiation, IR)与肿瘤转移的关系及相关机制,将为理解放疗后肿瘤转移的机制、优化临床放疗策略提供新的思路。研究表明,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤转移的重要机制之一。在一些细胞因子、生长因子等细胞外信号的刺激下,肿瘤细胞可以通过EMT获得迁移和侵袭能力,进而形成远位转移灶。其中,转化生长因子-β(transforming growth factor-beta, TGF-β)是肿瘤细胞发生EMT的重要诱导因子之一。值得注意的是,相关临床和实验研究结果显示,IR可以诱导肿瘤细胞及其周围组织TGF-β的活化,进而引起放射性炎症、纤维化、甚至肿瘤的转移和复发。因此,观察IR与EMT发生的相关性,以及TGF-β在其中所发挥的作用,将为明确IR和肿瘤转移的关系提供重要的实验证据。本研究以来源于三种组织、分别具有不同转移潜能的六种肿瘤细胞系为研究对象,通过形态学、EMT标志物和功能学指标研究了IR对EMT的影响,并围绕TGF-β表达水平的变化,通过特异性通路抑制剂的应用,进一步明确了TGF-β及其下游信号通路在IR诱导肿瘤细胞EMT中的作用。方法:1、选用人结直肠癌细胞SW480和SW620、人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、人肺癌细胞A549和PC14六种肿瘤细胞为研究对象,对其进行2 Gy60钴((60)Co)γ射线照射,通过显微镜观察、免疫印迹和免疫荧光、细胞划痕试验以及Transwell侵袭实验检测其形态学、EMT标志物、迁移和侵袭能力的变化,评价IR与EMT的相关性。2、利用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)观察2 Gyγ射线照射后上述六种肿瘤细胞TGF-β表达水平的改变。3、采用免疫印迹法研究IR对A549细胞p-Smad2/3表达的影响,通过给与ALK-5特异性抑制剂SB431542,观察TGF-β/Smad信号在IR诱导EMT中的作用。4、A549细胞经2 Gyγ射线诱导一次后,利用克隆形成实验检测其放射抗性。5、2 Gyγ射线照射后,检测A549细胞p-Akt的表达,通过给与PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002,观察Akt在IR诱导EMT中的作用;联合应用SB431542和LY294002,探讨TGF-β和Akt的关系。结果:1、经2 Gyγ射线照射后,六种肿瘤细胞均呈现出间质细胞样外观,与对照组相比,上皮标志物E-Cadherin和Cytokeratin表达降低,间质标志物N-Cadherin和Vimentin表达增高,划痕伤口愈合面积增大,Transwell小室穿膜细胞增多,提示本实验条件下的IR能够促进肿瘤细胞EMT的发生。2、六种肿瘤细胞经2 Gyγ射线照射后,TGF-β的表达水平明显升高。3、2 Gyγ射线照射后的A549细胞p-Smad2/3的表达明显升高;应用TGF-β/Smad通路的抑制剂SB431542处理后, p-Smad 2/3的水平降低,同时上皮标志物E-Cadherin表达升高,间质标志物N-Cadherin表达降低,划痕伤口愈合面积及Transwell穿膜细胞也明显减少。结果提示TGF-β/Smad信号在IR诱导肿瘤细胞的EMT中发挥一定的作用。4、经2 Gyγ射线诱导一次后的A549细胞再次接受γ射线照射,其存活率明显增高,表明A549细胞的放射抗性增加。5、2 Gyγ射线照射后的A549细胞p-Akt的表达明显升高;应用PI3K/Akt通路的抑制剂LY 294002处理后,p-Akt的水平降低,同时上皮标志物E-Cadherin表达升高,间质标志物N-Cadherin表达降低,划痕伤口愈合面积及Transwell穿膜细胞也明显减少。结果提示Akt信号在IR诱导肿瘤细胞的EMT中发挥一定的作用。进一步研究结果显示,当给与SB431542时,受照的A549细胞P-Smad 2/3和p-Akt的表达均降低,而当给与LY 294002时,p-Akt表达减少,而p-Smad 2/3则呈增加趋势。提示:在IR促进肿瘤细胞发生EMT的过程中,TGF-β也可通过激活Akt通路发挥作用。结论:IR能够促进离体肿瘤细胞EMT的发生,TGF-β诱导的Smad通路和Akt通路在其中均扮演着重要的角色。