乳腺癌干细胞是乳腺癌中存在的一小部分细胞，通过不断地自我更新和分化维持乳腺肿瘤的生长和发展，与乳腺癌的耐药、转移、复发以及低生存率有密切关系。目前临床使用的化疗药物（紫杉醇类，多柔比星以及顺铂类）针对的都是已分化的乳腺癌细胞，可有效地杀灭这类细胞，使肿瘤体积减小甚至消失。然而，肿瘤组织中的乳腺癌干细胞对化疗药物产生耐药性，在经过一段时间的休眠后，通过自我更新和分化形成新的肿瘤，导致乳腺癌的复发甚至转移。目前，较为广泛的认为乳腺癌干细胞的细胞表型为CD44+CD24-/low，继Al-Hajj等人从病人胸腔积液中首次分离出CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞后，Ponti等人首次通过无血清悬浮培养的方式从乳腺癌细胞系中分离出分化不成熟的乳腺癌干细胞，并且鉴定其细胞表型也为CD44+CD24-，这为体外建立乳腺癌干细胞模型奠定了实验基础。本文旨在利用乳腺癌干细胞上高表达的CD44为靶向受体，构建以HA为靶向配体的PLGA-b-HA自组装纳米粒，包载化疗药物(多西他赛，DTX)和乳腺癌干细胞特异性药物(莱菔硫烷，SFN)，通过透明质酸与CD44的特异性结合来实现乳腺癌干细胞的主动靶向性，再通过多西他赛和莱菔硫烷的联用同时消除分化的乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞。本文的研究内容分为四个部分：(1) PLGA-b-HA自组装纳米粒的构建及表征，包括PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成及表征、自组装纳米粒的制备和条件优化、载DTX纳米粒的制备及表征；(2) PLGA-b-HA自组装纳米粒的体外细胞学研究，包括体外CD44受体靶向性和DTX/SANPs体外抗乳腺癌活性；(3) PLGA-b-HA纳米粒的体内研究，包括体内乳腺肿瘤靶向性、药代动力学特征以及体内抗乳腺癌活性评价；(4)载DTX和载SFN的PLGA-b-HA纳米粒的抗乳腺癌及乳腺癌干细胞研究，包括乳腺癌干细胞的分离和鉴定、乳腺癌干细胞对PLGA-b-HA纳米粒的摄取、SFN载药纳米粒的制备及表征、体内外抗乳腺癌及乳腺癌干细胞活性评价。第一部分，通过还原胺化的方法在透明质酸的还原性末端接上丁二胺，然后再与PLGA的琥珀酰亚胺酯反应生成PLGA-b-HA嵌段共聚物。通过H-NMR和FT-IR鉴定PLGA-b-HA的成功合成。以芘为荧光探针测定不同亲疏水片段组成的PLGA-b-HA的临界胶束浓度(CMC)，随着亲水片段的增加，CMC从2.0mg/L增加到19.9mg/L。以溶剂透析法为基础制备空白和载药的PLGA-b-HA纳米粒。考察了不同亲疏水片段的PLGA-b-HA纳米粒的粒径，zeta电位和形态结构，筛选出具有典型核-壳型结构，粒径小且表面电荷量大的PLGA502H-b-HA5.6k纳米粒(SANPs)做进一步研究。以PLGA502H-b-HA5.6k为研究对象，通过单因素实验考察了溶剂，聚合物浓度，pH条件对纳米粒粒径及zeta电位的影响，优化了纳米粒的制备条件。结果表明聚合物在DMSO/DMF(v/v=3:1)溶剂中的溶解性最好，在pH=6-8，聚合物浓度小于3mg/ml时可制备电荷量大(zeta电位-25~-30mV)，粒径较小(<200nm)的PLGA-b-HA自组装纳米粒。SANPs可有效包载多西他赛(DTX，载药量~3%)，并且DTX在PLGA502H-b-HA5.6k纳米粒中以无定型状态存在。DTX/SANPs在pH=5.5和pH=7.4的条件下，DTX均呈两相释放，在pH=7.4的条件下释放略显缓慢。第二部分，以CD44高表达的MDA-MB-231细胞和CD44低表达的MCF-7细胞为模型，以香豆素-6为荧光探针包载于PLGA502H-b-HA5.6k纳米粒中，考察PLGA-b-HA纳米粒的体外CD44受体靶向性。结果表明SANPs在CD44受体高表达的MDA-MB-231细胞中摄取明显强于非CD44靶向的PLGA502H纳米粒，并且可以受到游离HA的竞争性抑制，说明SANPs可通过HA-CD44相互作用被摄取进入MDA-MB-231细胞，即PLGA-b-HA具有CD44受体靶向功能。另外，本部分还评价了DTX/SANPs在两种细胞中的细胞毒性，以及对CD44受体高表达的MDA-MB-231细胞的细胞周期及细胞凋亡实验。结果表明空白纳米粒对MCF-7和MDA-MB-231细胞均无毒性，而DTX/SANPs可增强对MDA-MB-231的细胞毒性。与非靶向的DTX/PLGA纳米粒相比，DTX/SANPs能更有效地将MDA-MB-231细胞阻滞于G2/M期，并诱导更多的细胞发生早晚期凋亡。第三部分，建立了MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型，以DiR为荧光探针包载于SANPs和PLGA502H中，评价其体内分布及乳腺肿瘤靶向性。实验结果表明两种纳米粒都主要分布于肝、肺、脾以及肿瘤组织中，DiR/SANPs在肺中最多，DiR/PLGA在肝中最多。相对于DiR/PLGA纳米粒，DiR/SANPs能更多的蓄积于肿瘤组织中，说明SANPs具备主动靶向CD44受体高表达的乳腺肿瘤的能力。采用HPLC-MS分析了游离DTX (希存)、DTX/PLGA纳米粒和DTX/SANPs纳米粒在SD大鼠中的药代动力学特征。实验结果表明两种载药纳米粒均可延缓DTX在血浆中的消除，与DTX和DTX/PLGA相比，DTX/SANPs组的t1/2和AUC更大，而清除率更小，说明DTX/SANPs能更有效的延缓DTX从血循环中的清除，增长其循环时间。建立MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型，评价了游离DTX (希存)，DTX/PLGA纳米粒和DTX/SANPs的体内抗乳腺癌活性及系统毒性。结果显示DTX (希存)，DTX/PLGA纳米粒以及DTX/SANPs的抑瘤率分别为77.10±6.87%，85.96±3.24%，92.22±2.06%。DTX/SANPs纳米粒展现了最强的抑瘤能力，且无明显的毒副作用。第四部分，在前期研究基础上，将乳腺癌干细胞敏感性药物莱菔硫烷(SFN)包载于PLGA502H-b-HA5.6k纳米粒中，与DTX/SANPs联用，用于同时消除乳腺癌及乳腺癌干细胞。(1)通过无血清悬浮培养的方法从MCF-7细胞系中分离出表型为ESA+CD44+CD24-乳腺球细胞(MCF-7MS)作为体外乳腺癌干细胞模型。MCF-7MS中ALDH阳性细胞比例明显高于MCF-7，并且相对于MCF-7而言，MCF-7MS高表达肿瘤干细胞自我更新蛋白（β-连环蛋白和细胞周期素D1），说明通过悬浮培养的方式分得的悬浮细胞具有一定的肿瘤干细胞特性，可作为体外乳腺癌干细胞模型。(2)以香豆素-6为荧光探针，包载于PLGA502H纳米粒和SANPs中，评价SANPs对乳腺癌干细胞的靶向性。结果表明SANPs在乳腺癌干细胞中摄取明显强于非CD44靶向的PLGA502H纳米粒，并且可以受到游离HA的竞争性抑制，说明SANPs可以通过其表面的HA与乳腺癌干细胞表面的CD44受体结合而内吞，达到主动靶向乳腺癌干细胞的目的。(3)以溶剂透析法为基础制备SFN/SANPs，与空白SANPs相比，载SFN后的SANPs的粒径变大，zeta电位略小，TEM形态显示SFN/SANPs分散良好，形态近似球形。体外释放表明SFN/SANPs呈两相释放，可在72小时内释放总药量的97%，具有一定的缓释功能。(4)体外细胞毒性试验表明乳腺癌干细胞(MCF-7MS)对SFN的敏感性比贴壁细胞(MCF-7)高，但对DTX产生明显的耐药性。DTX/SANPs，SFN/SANPs比相应的游离药物对两类细胞均显示了更强的细胞毒性。(5)通过乳腺球形成和β-连环蛋白的表达考察了SFN及SFN/SANPs的体外抗乳腺癌干细胞活性。结果表明SFN/SANPs比SFN可更有效抑制乳腺球形成(数量减少)，并且减小形成乳腺球的体积。另外，DTX及DTX/SANPs不能下调β-连环蛋白的表达，但SFN及SFN/SANPs可以显著的降低MCF-7MS中β-连环蛋白的表达。(6) DTX与SFN联用后可以显著地增强对MCF-7细胞的作用，但对MCF-7MS细胞的增强作用不明显。DTX/SANPs和SFN/SANPs的联用比游离药物的联用，能更有效的抑制乳腺癌细胞(MCF-7)及乳腺癌干细胞(MCF-7MS)的生长和增值。(7)建立MCF-7荷瘤小鼠模型，评价了DTX，SFN及其纳米粒的体内抗瘤、抗乳腺癌干细胞活性。DTX/SANPs和SFN/SANPs比相应的游离药物展现了更强的肿瘤抑制作用，并且无明显的毒副作用。DTX和SFN的联用比单用能更好的发挥抑瘤效果，并且DTX/SANPs和SFN/SANPs的联用的抗肿瘤效果比DTX和SFN联用效果更佳。(8)通过肿瘤组织细胞再次悬浮培养的成球数量及肿瘤组织中β-连环蛋白和细胞周期素D1的含量来评价体内抗乳腺癌干细胞活性。结果表明DTX及DTX/SANPs处理组虽降低悬浮球大小，却在一定程度上增加了悬浮球的数量，蛋白水平上亦不能降低β-连环蛋白的表达水平；SFN及SFN/SANPs处理组明显降低悬浮球的数量及大小，并且可以明显降低β-连环蛋白的表达水平；DTX和SFN联用以及纳米粒联用组均可以有效的抑制悬浮球的大小并降低其数量，同时也可以降低β-连环蛋白的表达水平。综上所述，DTX/SANPs和SFN/SANPs的联用可以同时消除乳腺癌及乳腺癌干细胞，达到最优的抗癌活性。