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研究背景:下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squmous cell carcinoma,HSCC),是头颈部常见的恶性肿瘤,发病率约占头颈鳞状细胞癌的5%。早期可表现为咽异物感、吞咽阻挡感等,随着肿瘤逐渐长大,其表面可发生破溃,进而引起吞咽疼痛、同侧反射性耳痛,常伴进行性吞咽困难,累及喉腔时可引起声音嘶哑、呼吸困难等。下咽鳞状细胞癌大多分化程度差,易黏膜下浸润扩散,早期临床症状不明显,不易早期发现,所以,在临床就诊时多已累及舌根、喉腔和颈段食管等邻近部位,并出现颈部淋巴结转移或远处转移。近年来随着头颈外科诊疗技术的不断发展,多种不同方法例如手术治疗、放射治疗、化疗药物治疗以及三种疗法相结合综合抗癌治疗的应用,患者生存率有所改善,但期患者年生存率仍仅为25%-40%。此外,下咽癌手术当中所需切除的范围较大,术后患者常常会出现吞咽功能异常、发声功能丧失等状况,这严重影响了患者术后的生活质量,而正常生理功能的缺失也对患者心理状态造成不良影响。为了改善患者的生存状态,提高患者5年存活率,对于下咽癌的有效药物治疗方案成为目前亟须解决的课题。二甲双胍(metformin)是一种双胍类口服降糖用药,是治疗内分泌代谢异常所造成的二型糖尿病的一线用药。近年来,人们发现在二型糖尿病患者中,二甲双胍的使用能够明显减少多种肿瘤的发病率。因此,针对二甲双胍与恶性肿瘤发生关系吸引了广泛地研究兴趣,并开展了进行了大量研究调查。目前,体外实验亦证明二甲双胍具有抑制多种恶性肿瘤细胞(包括肝癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌等)生长增殖的作用,但尚未发现其对咽喉癌的作用报道。microRNA是真核生物中的一类非编码小分子RNA,人们在肿瘤细胞中发现了数类microRNA的表达量异常,其对细胞的形成、增殖等存在多种影响。随着microRNA的研究逐渐火热,在针对microRNA与肿瘤关系的研究过程中,人们在多种肿瘤细胞中发现了 miR-21-5p这一 microRNA的表达量异常,其下游靶基因程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)的mRNA和相应蛋白表达水平也随之变化。PDCD4被认为是一种肿瘤抑制因子,其水平上升预示着肿瘤增殖受抑制。下咽癌细胞也是存在miR-21-5p显著上调的肿瘤细胞之一。目的:证明二甲双胍对人下咽癌细胞FaDu细胞系增殖的抑制作用,研究其对miR-21-5p和PDCD4基因表达水平的影响,初步阐明二甲双胍抑制FaDu细胞系增殖的可能机制:二甲双胍通过下调miR-21-5p表达水平及上调PDCD4蛋白表达水平而实现对FaDu细胞增殖的抑制作用。方法:1.细胞培养:于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC(?),Manassas,VA,USA)购买获得人下咽癌细胞FaDu细胞系,使用添加了 10%胎牛血清、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM),于37℃、5%二氧化碳浓度的培养箱中培养。2.细胞处理:细胞以2×104/ml/孔的密度接种至96孔板,37℃、5%CO2的培养箱中培养36小时,用磷酸缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)冲洗2次后每组用10μl应浓度二甲双胍进行处理。FaDu细胞被分为对0mmol/L对照组、25mmol/L二甲双胍处理组、50mmol/L二甲双胍处理组、75mmol/L甲双胍处理组、100mmol/L甲双胍处理组、125mmol/L二甲双胍处理组。各组分别在12小时、24小时和36小时取样进行细胞增殖检测。3.细胞增殖检测:利用CCK-8试剂盒(Dojindo,Kunamoto,Japan)检测细胞增殖情况。向96孔板的每个孔中加入10μl的CCK-8溶液。再次将96孔板放到上述条件培养箱孵育一段时间(1h-4h)。最后用酶标仪测定3次在光波450 nm处的每孔的吸光度(optical density,OD),取平均值。以此计算生长抑制率,公式如下:(实验组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100%。4.核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取和实时定量逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,Real time qRT-PCR):用于检测miR-21-5p和程序性细胞死亡因子4(programmed cell death4,PDCD4)mRNA 的表达。将总 RNA 严格按照 Trizol 试剂盒((Invitrogen,Grand Island,NY,USA)的说明书从细胞当中提取。使用Poly(A)加尾方法反转录cDNA。miR-21-5p的反转录过程是使用U6 RNA作为内参,使用复能基因公司生产的microRNA 反转录 PCR 检测试剂盒(FulenGen Corporation,Guangzhou,China)进行逆转录。循环条件:95℃ 10min→(95℃ 10s,60℃ 20s,72℃ 10s)×40循环→4℃。PDCD4 mRNA的反转录使用的是Roche公司出产的SYBR(?)Green I实时定量 PCR 试剂盒(Roche Corporation,Basel,Switzerland),使用 β-actin 作为内参。循环条件:95℃ 20s→(95℃ 3s,55℃ 30s)×40 循环→4℃。所有 PCR反应都进行了三次重复。PCR目的片段的表达水平通过与对照组对比用2-△△et法进行测定。5.蛋白质印迹法:用于检测PDCD4蛋白表达量水平。细胞经不同浓度二甲双胍(0mmol/L、25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L)处理 24 小时后,用 PBS 清洗 2 次,使用 RIPA(Beyotime,Jiangsu,China)冰上裂解 30min。将裂解后的液体以12000×g转速在4℃条件下离心5min。取上清液用BCA检测盒(Beyotime)测定蛋白浓度。总蛋白(40μg)使用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到聚偏氟乙烯膜,使用5%的脱脂牛奶常温封闭2小时。用小鼠抗人β-actin 单克隆抗体(1:1000 稀释,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)或兔多克隆抗人 PDCD4 抗体(1:2000 稀释,Abeam Corporation,Cambridge,UK)4℃孵育过夜,使用吐温20%Tris盐缓冲液冲洗3次,然后用辣根过氧化物酶山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1:5000稀释,Santa Cruz Biotechnology)室温孵育1小时。免疫反应蛋白条带采用增强化学发光分析(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒(Beyotime)根据使用说明严格操作进行检测。并使用Image J((Image Processing and Analysis in Java)软件分析定量。所有检测都进行了二次重复。6.数据统计分析:使用单项方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)检测组间差异。使用q检验(Student-Newman-Keulstest,SNK法)进行配对检验。数据分析通过 SPSS 17.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)Windows 版进行分析。P值<0.05时认为有统计学意义。结果:1.二甲双胍显著抑制FaDu细胞增殖,其抑制效应与剂量(P<0.05)及时间(P<0.05)相关。在25mmol/L-100mmol/L浓度范围内,二甲双胍浓度越高,抑制效应越明显。在以上浓度范围内,浓度不变时,12h-36h时间范围内,培养时间越长,细胞增殖抑制越明显。对于浓度100mmol/L和125mmol/L的二甲双胍处理后,所有时间点的细胞增殖状态都没有区别,抑制达到平台期。说明二甲双胍对FaDu细胞的抑制作用是存在剂量依赖的,但当二甲双胍浓度高于100mmol/L时达到饱和状态。2.以25mmol/L-100mmol/L浓度范围内的二甲双胍处理FaDu细胞24h,能够显著抑制miR-21-5p表达水平(P<0.05),而同时PDCD4 mRNA和蛋白表达水平均呈现明显上升(P<0.05),说明二甲双胍很可能通过miR-21-5p调控PDCD4的表达,进而影响FaDu细胞的增殖情况。结论:1.二甲双胍能够显著抑制FaDu细胞的增殖,在25mmol/L-100mmol/L浓度范围内呈明显的剂量依赖效应。2.二甲双胍对细胞增殖的抑制作用可能通过下调miR-21-5p表达水平及上调PDCD4蛋白表达水平而实现。