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蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7, sucrose phosphorylase, Spase)能够特异性的催化转移葡萄糖苷键。该酶能够以蔗糖或1-磷酸葡萄糖为葡萄糖基供体,以含有酚羟基、羧基及醇羟基的物质为受体,催化合成各种糖苷,在改善经济类化合物水溶性、稳定性及生物相容性方面,具有重要的应用价值。本论文首先从长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)中克隆了一条蔗糖磷酸化酶基因(命名为BLSpase),并对其进行了原核表达及纯化。所得重组酶的分子量约为57kDa,纯度高于95%。BLSpase在30℃,pH 7.0条件下的比活力为2.143 U/mg；其最适反应温度和pH值分别为45℃和6.0；且Co2+对BLSpase的活性有激活作用。其次,研究了戊二醛(GA)制备交联酶聚集体的工艺。在沉淀过程中加入一定量的牛血清白蛋白(BSA)可以使酶活回收率达到76%以上。该法制备的共交联聚集体(命名为BSA-BLSpase-CLEAs)的最适反应温度较游离酶提高了5℃,并且在60℃保温1小时后仍有86%的相对剩余活力；4℃储存15天后,其相对剩余活力为80%; Mn2+、Cu2+和Co2+可以激活BSA-BLSpase-CLEAs。最后,分别以GA和三羟甲基磷(THP)为交联剂,实现了BLSpase在壳聚糖微球载体上的固定化。在最优固定化条件下,采用GA为交联剂,制备的固定化酶(命名为GA-BLSpase)的活力为217.2U/g,其最适反应温度较游离酶提高了15℃；采用THP为交联剂,制备的固定化酶(命名为THP-BLSpase)的活力为346.2 U/g,其最适反应温度较游离酶提高了20℃,最适pH向酸性方向偏移3个单位,在pH 4.0的条件下孵育30分钟后,相对剩余活力为100% Li+、Cu2+和Mg2+对GA-BLSpas e具有较弱的激活作用；而Mn2+可以使THP-BLSpas e的活性提高到原来的1.2倍。综上所述,固定化蔗糖磷酸化酶的最适反应温度和热稳定性均较游离酶有所提高。其中GA-BLSpase和THP-BLSpase的热稳定性更强,适合在高温下反应,且具有较好的操作稳定性,可以应用于具有较高反应温度的工业生产中。而BSA-BLSpase-CLEAs的储藏稳定性更佳,可以满足长期保存运输的需要。THP-BLSpase在酸性条件下具有较高的活性和较强的耐受力,适合催化带有羧基的酸性受体的转糖苷反应。由此可见,采用不同的固定化方法可以获得具有多样性酶学性质的固定化酶,以满足工业化生产的不同需求,极大的扩展了蔗糖磷酸化酶在工业生产中的应用范围和价值。