人大肠癌HT-29细胞系Livin基因相关miRNAs的筛选

来源 :南昌大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangshilei19850715
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目的:1、探讨siRNA抑制Livin基因表达对人大肠癌HT-29细胞系miRNA表达谱的影响。2、结合生物信息学技术,采用实时荧光定量PCR验证,筛选出Livin基因的相关miRNAs。方法:1、实验分为三组,转染Livin-siRNA组为实验组,转染无义siRNA组为阴性对照组,转染空载组为空白对照组。脂质体2000转染48h后,采用实时定量PCR分别检测3组细胞Livin mRNA的表达变化。2、采用miRNA芯片(miRNAmicroarray)技术检测Livin-siRNA实验组和阴性对照组HT-29细胞中差异表达的miRNAs。3、采用生物信息学技术预测Livin基因相关的miRNAs,结合相关文献分析进一步筛选出Livin基因的相关miRNAs。3、采用实时定量PCR验证差异表达的miRNAs分子。结果:1、Lipo2000转染后48h,Livin-siRNA实验组、阴性对照组、空白对照组HT-29细胞中Livin mRNA的相对表达量分别为0.365±0.072,1.043±0.027,1。结果表明,Livin-siRNA实验组中Livin mRNA的表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),而阴性对照组和空白对照组中Livin mRNA的表达水平无明显差异(P>0.05)。2、miRNA芯片结果显示,Livin基因表达下调后,miRNA表达谱发生明显变化,共有117条miRNAs呈差异表达。与阴性对照组相比,Livin-siRNA实验组中有71条miRNAs表达水平上调,46条miRNAs表达水平下调,差异具有统计学意义(P均<0.05)。3、生物信息学软件预测结果发现有60条Livin基因相关的miRNAs,结合miRNA芯片结果筛选出以下7条符合条件的miRNAs,其中hsa-miR-486-3p、hsa-miR-4688、hsa-miR-3918、hsa-miR-762、hsa-miR-3620-5p表达上调,而hsa-miR-3135b、hsa-miR-148b-3p表达下调。文献检索发现hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3p与肿瘤的发生发展密切相关,因此我们进一步采用实时荧光定量PCR进行验证。4、Lipo2000转染后48h,Livin-siRNA实验组HT-29细胞hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3p mRNA的相对表达量分别为2.254±0.272,2.484±0.337,0.645±0.100,阴性对照组hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3pmRNA的相对表达量分别为0.882±0.067,0.842±0.080,1.083±0.029,空白对照组hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762、hsa-miR-148b-3p mRNA的相对表达量均为1。Livin基因表达抑制后,hsa-miR-486-3p、hsa-miR-762mRNA的表达水平升高(P<0.05),而hsa-miR-148b-3p mRNA的表达水平下降(P<0.05),阴性对照组和空白对照组无明显差异(P>0.05)。结论:1、脂质体介导的siRNA干扰能有效抑制人大肠癌细胞系HT-29细胞中的Livin基因表达。2、Livin基因表达抑制后,HT-29细胞miRNA表达谱发生明显改变。3、hsa-miR-486-3p、762、148b-3p是Livin基因相关的3条miRNAs。
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