【摘 要】
:
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶彻底水解纤维素的关键酶种,目前制约β-葡萄糖苷酶在工业生产中运用的一个瓶颈,就是酶活力和稳定性都普遍较低,因此通过基因工程和蛋白质工程技术对β-
论文部分内容阅读
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶彻底水解纤维素的关键酶种,目前制约β-葡萄糖苷酶在工业生产中运用的一个瓶颈,就是酶活力和稳定性都普遍较低,因此通过基因工程和蛋白质工程技术对β-葡萄糖苷酶进行改造具有重要的科学和实用价值。 本实验利用定向进化技术中较为成熟的一种方法——易错PCR,对β-葡萄糖苷酶进行基因改造。通过优化易错PCR体系中Mn2+浓度(0.10mmol/L),Mg+浓度(7mmol/L),获得突变基因文库,然后将易错PCR产物构建入载体质粒pPCZαA中,线性化后,转入巴斯德毕赤酵母工程菌X33中,形成突变体库。 利用高通量筛选方法进行筛选,获得了一株较高酶活性的产β-葡萄糖苷酶突变基因工程菌pPICZaA-bglep7。通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化,SDS-PAGE检测有大小94KD的单一蛋白条帝,与理论值大小基本一致,得到了纯化的β-葡萄糖苷酶蛋白。纯化后的β-葡萄糖苷酶酶活为20.628 U/mL,比出发菌株(17.19 U/mL)提高了12%,比活为72.126 U/mg,比改造前提高了1.2倍。对β-葡萄糖苷酶酶学性质分析得知,它的最适温度为50℃,在20℃-50℃的环境中,酶活力稳定性好,和突变前基本保持一致;在环境pH为4.0-6.0时,其酶活力能够维持较高水平,最适pH为5.5,比原始菌株提高了0.5个pH单位。 DNA测序结果表明中突变β-葡萄糖苷酶基因有13个碱基发生了突变,并引起了5个氨基酸的变化,分别是Glu127Lys、Lys178Arg、Leu487Thr、Ala807Gly、Glu811Gln。经软件分析预测发现,突变基因工程菌表达的β-葡萄糖苷酶蛋白质二级结构与未突变一致,等电点与理化性质均未发生明显变化。通过同源建模预测三维结构分析发现,突变菌株pPICZaA-bglep7表达的β-葡萄糖苷酶与未突变的具有相同的多肤骨架,三维结构一致,活性中心没有改变,而五个氨基酸突变可能只使酶蛋白结构发生了微变化,增加了酶蛋白结构柔性,从而引起酶活力提高。为进一步通过定向进化改造β-葡萄耱苷酶奠定了基础。
其他文献
目的 分析2016~2018年我国坚果炒货食品的安全形势.方法 汇总2016~2018年坚果炒货食品国家食品安全监督抽检结果,对其不合格项目等信息进行分析.结果 2016~2018年共抽检坚果炒货
风力发电是一种可再生的清洁能源,它能够给我们带来很好的环境效益、经济效益以及社会效益。随着经济的发展,人类对能源的需求越来越大,风能的开发是解决能源需求的主要途径之一。在能源利用方面,大功率并网型风力发电是目前高效利用风能的主要方式。并网型风力发电系统的作用是将不断变化的风能通过风轮机转换成机械能,再通过发电机将机械能转换成电能,最后并入电网。由于带有增速齿轮箱的定速恒频风电机组具有运行效率低、噪
该文从以下几个方面对银杏黄酮的免疫调节及抗肿瘤活性进行了研究:1,通过ELISA法测定了银杏黄酮对体外培养小鼠脾脏细胞产生的细胞因子的影响.2,通过微核实验,测定了银杏黄酮
应用alamar Blue Assay测定了香菇子实体、云芝和冬虫夏菌丝体以及香菇粗提物层 析组分对体外培养癌细胞抗增殖作用.研究表明香菇多糖对荷瘤动物比PHA具有更好的免疫 激活作
展青霉素是一种有害的真菌毒素代谢物,主要对人类的中枢神经系统造成影响,且对消化系统和肾脏也造成不同程度的毒害影响.展青霉素在食品中的污染是世界各地普遍存在的问题,尤
1〕中国2型糖尿病患者红细胞葡萄糖运输速率的变化具有不对称性,输入速率减慢而输出速率没有明显变化;2〕患者红细胞葡萄糖运输的温度依赖发生改变,葡萄糖输入的活化能变化与
1.该文以广东省花都市新华镇为例,以工业化、城市化过程中城镇结构转型为景,通过环境质量系统分析探讨珠江三角洲小城镇的可持续发展问题;2.该文设计了环境意识调查问卷;3.通
该研究在中国羊草分布中心--松平原中部和南部地区,选取不同生境下两种叶色类型共11个天然种群通过移栽实验、等位酶分析和RAPD,首次同时在形态学、蛋白质和DNA三个层次上研
为了促进白桦提前开花,在大棚内对白桦进行各种强化处理,主要措施有喷糖和施放不同浓度CO,同时测定了相应生理生化指标.从实验结果可知,大棚本身的环境条件配以强化措放,使白
目的 对劲骨胶囊功效成分进行鉴别并对其主要的功效成分盐酸氨基葡萄糖的含量进行测定.方法 采用化学反应法、薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)及高效液相色谱法(h